गुणवत्ता Inositol Pyrophosphates की तैयारी

Summary

Inositol pyrophosphates मानव विकृतियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जैसे कैंसर, मधुमेह और मोटापा, तथापि, कार्रवाई की सटीक व्यवस्था विवाद का एक मामला है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध inositol pyrophosphates की कमी renders विस्तृत अध्ययन समस्याग्रस्त. यहाँ हम एक सरल उत्पादन और inositol pyrophosphates के मिलीग्राम अलग प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP₅) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP₆). IP₅ and IP₆ are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds¹. Phosphorylation of IP₆ generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP₇ or PP-IP₅) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP₈ or (PP)₂-IP₄). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution^2-4.

The IP₆ kinases (IP₆Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP₅ and IP₆ to PP-IP₄ and IP₇ respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules^5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP₁ (also referred as PP-IP₅K), which is able to convert IP₆ to IP₇ and IP₈^7,8.

Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion⁹, telomere length^10,11, chemotaxis¹², vesicular trafficking¹³, phosphate homeostasis¹⁴ and HIV-1 gag release¹⁵. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT¹⁶. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins¹⁷. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus^18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation²⁰ and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.

In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP₆-kinase and PP-IP₅-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates²⁰. Following IP₆K1 and PP-IP₅K enzymatic reactions using IP₆ as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Protocol

1. Enzymatic रिएक्शन – 1 दिन (दोपहर में 1 घंटे) पहला कदम 10-20 स्वतंत्र एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जिसमें 6 आईपी K1 या VIP1 pyrophosphorylated isoforms 6 आईपी बदलने को तैयार है . हम उसका आईपी 6 K1 और जीएसटी – Vip1 एंजाइमों ई. से शुद्ध का उपयोग करें प्रोटोकॉल के अनुसार कोली पहले 17,18 वर्णित. 50 μL 1X प्रतिक्रिया बफर (30 मिमी 6.8 पीएच Hepes, 50 मिमी NaCl, 6 मिमी MgSO 4, 1 मिमी डीटीटी), 6 मिमी PhosphoCreatine (पीसीआर), 25 यू / एमएल CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 मिमी एटीपी (मिलीग्राम से युक्त प्रतिक्रियाओं तैयार नमक), 0.3 मिमी IP6, 0.05-0.1 μg उसका आईपी 6 K1 या जीएसटी Vip1. MiliQ DDH 2 ओ के साथ मात्रा समायोजित करें संक्षेप में प्रतिक्रिया और 37 पर सेते ° सी रातोंरात रोटेशन के साथ स्पिन. 2. Polyacrylamide जेल कास्टिंग और लोडिंग – 2 दिन (दोपहर में 4 घंटे) polyacrylamide जेल 24 लंबा, 18 सेमी चौड़ा गिलास प्लेट सेमी और 1.5 मिमी चौड़े spacers का उपयोग करने के लिए तैयार है. आम तौर पर एक 16 लेन या एक प्रारंभिक सिंगल लेन कंघी इस्तेमाल किया जाता है. 35.5% (w / v) Acrylamide:: बीआईएस Acrylamide 19:01, अमोनियम 1X Tris / / borate EDTA (TBE), 0.05% (w / v) (persulfate ए पी एस (50 एमएल / जेल) मिश्रण निम्नलिखित युक्त तैयार ), 0.05% (w / v) Temed. पूर्व casted गिलास प्लेटों के बीच मिश्रण डालो, कंघी सम्मिलित और आरटी पर 30-60 मिनट के लिए polymerize चलो. एक बार जेल polymerized है, ठंडे कमरे में तंत्र हस्तांतरण और पूर्व 200-300 वोल्ट पर 30-60 मिनट के लिए के बारे में 1X TBE में चलाने के. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए OrangeG डाई के 1X (10 मिमी pH7.0 Tris – एचसीएल, 1 मिमी EDTA, 30% ग्लिसरॉल, 0.1% OrangeG) जोड़ें. 6 आईपी 2 nmol युक्त एक मानक नियंत्रण के रूप में लोड करने नमूना तैयार. बफर एक सिरिंज और किसी भी वेग को निकालने के लिए एक 21G सुई का उपयोग कर चलाने के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से अच्छी तरह धो, तो जेल लोड. पक्ष कुओं पर लोड हो रहा से बचें. 450-550 वोल्ट (7 mAmp / जेल) में रात भर जेल चलाएँ, जब तक OrangeG डाई बैंड जेल के नीचे से पिछले 10 सेमी के भीतर है. 3. 7 आईपी अलगाव – 3 दिन (4 घंटे) और 4 दिन (6-7 घंटे SpeedVac सुखाने की प्रक्रिया) जेल तंत्र जुदा और ध्यान से एक गिलास प्लेट एक दूसरे पर जेल छोड़ने हटायें. काटें बस OrangeG डाई बैंड के ऊपर से एक जेल के एक छोटे से हिस्से आईपी 6 मानक और एक नमूना लेन युक्त नीचे करने के लिए, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है. Toluidine ब्लू (0.1% (w / v), 20 (w / v)% मेथनॉल, toluidine नीले 2 (w / v)% ग्लिसरॉल) के साथ कुछ मिनट के लिए जेल की कटौती भाग (1-3 मिनट) या दाग inositol पाइरोफॉस्फेट बैंड तक दिखाई देता है. कांच पहले सूखने से अस्थिर जेल को रोकने के लिए जेल की शीर्ष पर वापस हटा थाली रखो. IP 7 बैंड दिखाई जा सकता है के बाद से यह थोड़ा IP 6 मानक की तुलना में धीमी रन चाहिए. एटीपी है, जो 6 आईपी की तुलना में तेजी से रन भी दिखाई दे सकता है (चित्रा 1 ) चाहिए. एक समाधान de धुंधला हो जाना (20 (w / v)% मेथनॉल) में कुछ मिनट के लिए जेल के दाग भाग स्थानांतरण, दूर Toluidine ब्लू के किसी भी अतिरिक्त धोने और बेदाग जेल के साथ जेल reposition. यदि उच्च pyrophosphorylated inositol isoforms (8 आईपी और आईपी 9) के दृश्य की आवश्यकता है, Toluidine ब्लू धुंधला समाधान के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए जेल दाग. बाद में, दूर के बारे में 15 मिनट के लिए समाधान de धुंधला हो जाना के साथ Toluidine ब्लू धो लो. एक धार के साथ संदर्भ के रूप में आईपी 7 पलायन दाग जेल (चित्रा 1) के साथ निर्धारित स्थिति का उपयोग कर जेल की बेदाग भाग पर आईपी 7 बैंड में कटौती. आईपी ​​7 बैंड है कि जेल से एक 15 एमएल ट्यूब पर काट दिया गया रखो और MilliQ DDH 2 ओ के 10 एमएल जोड़ने रोटेशन में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों का रखो. TBE और सूक्ष्म acrylamide कणों से अधिक दूर तरल त्यागें. बाद में, दो निर्जलीकरण जलयोजन चक्र करते हैं. ट्यूब आईपी 7 युक्त जेल के साथ 50 (w / v)% मेथनॉल के 5 एमएल जोड़ें 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बारी बारी से. एक नया 15 एमएल MilliQ DDH 2 हे 5 एमएल युक्त ट्यूब जेल टुकड़ा स्थानांतरण और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बारी बारी से. और ट्यूब से मेथनॉल MilliQ एच 2 हे त्यागने मत करो. निर्जलीकरण – जलयोजन चक्र फिर 15 एमएल पहले प्रयोग किया जाता ट्यूबों स्थानांतरित में polyacrylamide जेल से एक बार और दोहराएँ. Washes के एक रात खत्म किया जा सकता है. Eluted 7 आईपी ध्यान केंद्रित करने के लिए, 10 एमएल के साथ शुष्क (5 एमएल MilliQddH 2 हे और 5 एमएल 50% मेथनॉल (w / v)) एक 60 में गर्म SpeedVac ° सी. का उपयोग एक बार नमूने लगभग सूख रहे हैं, a1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और 5000 rpm पर 2 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए शेष तरल हस्तांतरण (300-600 μl). एक ताजा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और हस्तांतरण लीजिए; छोड़नीचे 20-30 μL के बाद से यह acrylamide कणों को शामिल कर सकते हैं. यदि आवश्यक हो सुखाने प्रक्रिया का उपयोग कर एक unheated SpeedVac जारी है. 7 आईपी वसूली को नाटकीय रूप से अगर नमूने पूरी तरह से सूखे कम है, इसलिए सुखाने की प्रक्रिया समाप्त जब नमूने 100-300 μL की मात्रा तक पहुँचने. 4. आईपी ​​7 एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण. बरामद आईपी 7 नमूना एक पन्ना जेल पर चलाने के 2-5 μL इसी तरह 2.2-2.5 अनुभाग का उपयोग करें . एकाग्रता मानक और पाली – पी मार्कर के 4 nmol 6 आईपी कई dilutions (यानी 0.5, 1, 2, 4 nmol) के रूप में लोड करें. जेल चलाने के बाद, धुंधला हो जाना और धुंधला हो जाना Toluidine ब्लू समाधान के साथ पूरे जेल द्वारा inositol पाइरोफॉस्फेट isoforms 3.2 धारा (चित्रा 2A) में वर्णित प्रक्रिया के बाद, कल्पना. Toluidine धुंधला के बाद, सांद्रता जेल स्कैनिंग और तीव्रता में 6 आईपी और आईपी 7 के बीच मतभेद की तुलना, जैसे छवि जम्मू इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में चित्रा 2B में दिखाया गया है द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. 5. प्रतिनिधि परिणाम: 6 आईपी प्रारंभिक एंजाइमी 7 आईपी आईपी 6 K1 और VIP1 एंजाइमों का उपयोग करने के लिए रूपांतरण PAGE विश्लेषण (चित्रा 1) का उपयोग आसानी से हल कर सकते हैं. लोड हो रहा है की एक आकार पर नियंत्रण के रूप में आईपी Toluidine ब्लू जेल धुंधला के साथ एक साथ 6 pyrophosphorylated derivates की पहचान की अनुमति देता है, क्योंकि वे धीमी चलाने फॉस्फेट inositol अंगूठी पर मौजूद समूहों की संख्या पर निर्भर करता है. 7 आईपी के ऊपर वर्णित की प्रक्रिया आसान शुद्धि की अनुमति देता है . शुद्ध पन्ना पाइरोफॉस्फेट inositol का विश्लेषण हमारे 7 आईपी (2A चित्रा) की शुद्धता का पता चला. दिलचस्प है, VIP1 के आईपी 7 उत्पाद के 1/3PP-IP 5 isomer थोड़ा 5PP आईपी 7 आईपी के 5 isomer है कि आईपी 6 K1 द्वारा उत्पन्न होता है की तुलना में धीमी migrates . आईपी ​​6 मानकों का प्रयोग शुद्ध 7 आईपी (चित्रा 2B) की एकाग्रता का एक आसान मात्रा का ठहराव की अनुमति. आगे के प्रयोगों के लिए आईपी 7 का उपयोग करने से पहले, अपने जैविक गतिविधि का मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 3). 5PP आईपी 5 VIP1 के साथ और आईपी 7 DDP1 फॉस्फेट (diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase) के साथ incubated है . नियमित, शुद्ध 7 आईपी DDP1 (चित्रा 3) में VIP1 द्वारा 8 आईपी और आईपी 6 कनवर्ट किया जाता है . चित्रा 1: PAGE और आईपी 7 बैंड के अलगाव के Toluidine धुंधला मानक (6 आईपी) युक्त जेल के हिस्से में कटौती करने के लिए और एक Toluidine ब्लू समाधान का उपयोग दाग. तीन बैंड (ऊपर से नीचे) 7 आईपी, 6 आईपी और एटीपी प्रतिनिधित्व करते हैं. जेल के दाग भाग तो जेल के शेष के साथ गठबंधन किया गया था. यह आईपी 7, जो तब और कटौती जा सकता है शुद्ध (डैश्ड बॉक्स) से युक्त जेल के हिस्से का स्थानीयकरण अनुमति देता है . चित्रा 2: आईपी 6 K1 और VIP1 प्रतिक्रिया उत्पादों के PAGE विश्लेषण. ए) 6 आईपी Toluidine ब्लू धुंधला द्वारा विश्लेषण (4, 2, 1, 0.5 nmol) क्रम में आईपी 7 से दोनों आईपी 6 K1 (5 5PP – आईपी) और VIP1 (1/3PP-IP शुद्ध एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ) 5 प्रतिक्रियाओं.) बी स्कैटर साजिश विश्लेषण शुद्ध 7 आईपी की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए. सांद्रता बैंड तीव्रता, imageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना 6 आईपी के पूर्व निर्धारित मात्रा की तुलना में, अनुसार निर्धारित किया गया है. X-अक्ष तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, Y-अक्ष nmol में व्यक्त की सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 3: आईपी 7 जैविक गतिविधि का विश्लेषण शुद्ध 7 आईपी की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए हम VIP1 या आईपी 7 फॉस्फेट के साथ DDP1 5 5PP आईपी (आईपी 6 K1 उत्पन्न आईपी 7) incubated और तब पृष्ठ पर प्रतिक्रिया हल. DAPI और Toluidine धुंधला VIP1 द्वारा 8 आईपी की उम्मीद उत्पादन और 7 आईपी DDP1 द्वारा 6 आईपी रूपांतरण का पता चला.

Discussion

जैव रसायन में inositol पाइरोफॉस्फेट का उपयोग गंभीर रूप से ऐसे यौगिकों के वाणिज्यिक अनुपलब्धता और मौजूदा तरीकों का पता लगाने के गरीब संवेदनशीलता द्वारा सीमित है. पन्ना है, जो फॉस्फेट समूहों के विभिन्न संख्या है, और Toluidine (चित्र 1) ब्लू, एक metachromatic डाई जो फॉस्फेट समूहों को बांधता है, रखने के अणुओं की जुदाई में सक्षम ^{बनाता} है के संयोजन inositol pyrophoshate 20 अनुसंधान के नए रास्ते खोलने isoforms का आसान पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है.

पृष्ठ प्रौद्योगिकी के वर्णित उपयोग enzymatic प्रतिक्रिया के inositol पाइरोफॉस्फेट उत्पादों शुद्ध outby किया जाता है या तो आईपी K1 ₆ या VIP1 एक सरल, आर्थिक और विश्वसनीय तरीका है कि उच्च गुणवत्ता ₇ आईपी की बड़ी मात्रा में के उत्पादन के लिए अनुमति देता है. ऊपर वर्णित विधि आईपी के सरल शुद्धि के _लिए 7 सीमित नहीं है, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल के मामूली संशोधनों inositol pyrophosphates का एक अलग श्रेणी की शुद्धि की अनुमति दे सकता है. हायर phosphorylated inositol पाइरोफॉस्फेट isoforms, आठ से अधिक फॉस्फेट समूहों से युक्त ^एक 20,6 सब्सट्रेट के रूप _में 7 आईपी या _आईपी 6 के विभिन्न मात्रा का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. ये inositol pyrophosphates धुंधला प्रक्रिया की लंबाई बढ़ती है और बाद में शुद्ध (3.2 अनुभाग) के द्वारा पता लगाया जा सकता है. इसके अलावा, enzymatic प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट के _रूप में 5 आईपी _का उपयोग 5 पीपी आईपी की शुद्धि और अन्य inositol inositol की अंगूठी पर एक हाइड्रॉक्सिल समूह युक्त pyrophosphates की अनुमति होगी.

अंत में, इस उदार विधि व्यापक रूप से उपलब्ध उपकरणों के साथ inositol pyrophosphates milligram मात्रा के विश्वसनीय शुद्धि के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार इस रोमांचक अनुसंधान के क्षेत्र के लिए नए रास्ते खोलने.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Phytic Acid (IP6)	Sigma-Aldrich	P8810
Poly-P (sodium hexametaphosphate)	Sigma-Aldrich	P8510
ATP-Mg2+ salt	Sigma-Aldrich	A9187
OrangeG	Sigma-Aldrich	O3756
PhosphoCreatine (PCr)	Sigma-Aldrich	P7936
CreatinePhospho Kinase (CPK)	Sigma-Aldrich	C3755
GST-Vip1	17	17
His-IP6K1	18	18
His-Ddp1	Available in lab	Available in lab
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%)	Flowgen	H16972
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A9164
Tris/Borate/EDTA (TBE)	Sigma-Aldrich	T 9060
Temed	BDH	43083G
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	198161
SpeedVac	Christ	100218
Gel apparatus	Hoefer	SE600
Vacuum manifold	Christ	Alpha 2-4
Vacuum pump	ABM Greiffenberger	4EKF63CX