Pirofosfati inositolo svolgono un ruolo importante nelle patologie umane come il cancro, il diabete e l'obesità, ma l'esatto meccanismo d'azione è una questione di controversia. La mancanza di pirofosfati inositolo disponibili in commercio rende studi dettagliati problematico. Qui descriviamo un semplice protocollo per la produzione e isolare milligrammi di pirofosfati inositolo.
Myo-inositolo è presente in natura sia senza modifiche o più derivati complessi fosforilata. Delle più recenti, il più abbondante nelle cellule eucariotiche due sono pentakisphosphate inositolo (IP 5) e hexakisphosphate inositolo (acido fitico o IP 6). IP 5 e IP 6 sono i precursori di molecole pirofosfato inositolo che contengono uno o più legami pirofosfato 1. Fosforilazione di IP 6 genera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 o PP-IP 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 o (PP) 2-IP 4). Pirofosfati inositolo sono stati isolati da tutti gli organismi eucarioti sinora studiati. Inoltre, le due classi distinte di enzimi responsabili della sintesi pirofosfato inositolo sono altamente conservati durante l'evoluzione 2-4.
L'IP 6 chinasi (IP 6 Ks) possiede una flessibilità enorme catalizzatore, la conversione IP 5 e 6 al PP IP-IP IP 4 e 7 rispettivamente e successivamente, utilizzando questi prodotti come substrati, promuovere la generazione di molecole più complesse 5,6 . Recentemente, una seconda classe di enzimi pirofosfato generazione è stata individuata nella forma della proteina di lievito VIP 1 (noto anche come PP-IP 5 K), che è in grado di convertire IP da 6 a 7 e IP IP 8 7,8.
Pirofosfati inositolo regolano molti processi cellulari disparati quali la secrezione di insulina 9, la lunghezza dei telomeri 10,11, chemiotassi 12, il traffico vescicolare 13, 14 e omeostasi fosfato di HIV-1 gag rilascio 15. Due meccanismi di azione sono stati proposti per questa classe di molecole. Essi possono influenzare le funzioni cellulari da allosterically interagendo con proteine specifiche, come AKT 16. In alternativa, il gruppo pirofosfato può donare un fosfato di pre-fosforilata proteine 17. L'enorme potenziale di questo campo di ricerca è ostacolata dalla mancanza di una fonte commerciale di pirofosfati inositolo, che impedisce molti scienziati di studiare queste molecole e questa nuova modificazioni post-traduzionali. I metodi attualmente disponibili per isolare pirofosfati inositolo richiedono sofisticate apparecchiature cromatografiche 18,19. Queste procedure utilizzano condizioni di acidità che potrebbe portare al degrado pirofosfato inositolo 20 e quindi al recupero poveri. Inoltre, l'ingombrante post-colonna procedure di dissalazione limitarne l'uso a laboratori specializzati.
In questo studio descriviamo un metodo poco impegnativo per la generazione, l'isolamento e la purificazione dei prodotti di IP 6-chinasi e PP-IP 5-chinasi reazioni. Questo metodo è stato possibile grazie alla capacità di elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAG) per risolvere i polifosfati inositolo altamente fosforilata 20. A seguito di IP 6 K1 e PP-IP 5 K reazioni enzimatiche utilizzando IP 6 come il substrato, PAGINA è stato utilizzato per separare i pirofosfati generato inositolo che sono stati successivamente eluiti in acqua.
L'uso di inositolo pirofosfato in biochimica è severamente limitato dalla indisponibilità commerciale di tali composti e la scarsa sensibilità dei metodi di rilevazione già esistenti. La combinazione di pagina, che consente la separazione di molecole in possesso di diverso numero di gruppi fosfato e blu di toluidina (Figura 1), un colorante metacromatica che si lega ai gruppi fosfato, consente la facile individuazione delle isoforme pyrophoshate inositolo aprendo nuove vie di ricerca 20.
L'uso della tecnologia descritta PAGE per purificare i prodotti pirofosfato inositolo della reazione enzimatica svolta outby sia IP 6 K1 o VIP1 è un metodo semplice, economico e affidabile che consente la produzione di grandi quantità di IP di alta qualità 7. Il metodo sopra descritto non si limita alla purificazione semplice IP 7, ma piccole modifiche del protocollo descritto può permettere la purificazione di una diversa gamma di pirofosfati inositolo. Superiore fosforilata isoforme pirofosfato inositolo, contenente più di otto gruppi fosfato possono essere rilevati tramite IP 7 o diverse quantità di IP 6 come substrato 20,6. Queste pirofosfati inositolo possono essere rilevati aumentando la lunghezza della procedura di colorazione e successivamente purificato (sezione 3.2). Inoltre, l'uso di IP 5 come substrato per la reazione enzimatica che permette la purificazione di PP-IP 5 e altre pirofosfati inositolo contenente un gruppo idrossile sull'anello inositolo.
In conclusione, questo metodo permette di poco impegnativo per la purificazione affidabile di quantità milligrammo di pirofosfati inositolo con strumenti ampiamente disponibili, aprendo così nuove strade per questo campo di ricerca entusiasmante.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo A. Riccio per gli utili commenti e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council (MRC) i finanziamenti per l'Unità di Biologia Cellulare e da un Umano Frontier Science Grant Program (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |