Pirofosfatos inositol desempenhar um papel importante em patologias humanas como câncer, diabetes e obesidade, no entanto, o mecanismo exato de ação é uma questão de disputa. A falta de disponível comercialmente pirofosfatos inositol estudos detalhados torna problemática. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para produzir e isolar miligramas de pirofosfatos inositol.
Myo-inositol está presente na natureza ou não modificado ou mais complexos derivados fosforilados. Do último, os dois mais abundantes nas células eucarióticas são pentakisphosphate inositol (IP 5) e hexakisphosphate inositol (ácido fítico ou IP 6). IP 5 e IP 6 são os precursores de moléculas de pirofosfato inositol que contêm uma ou mais ligações pirofosfato 1. Fosforilação de IP 6 gera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 ou PP-PI 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 ou (PP) 2 IP-4). Pirofosfatos inositol foram isolados de todos os organismos eucarióticos, até agora estudados. Além disso, as duas classes distintas de enzimas responsáveis pela síntese de pirofosfato inositol são altamente conservadas ao longo da evolução 2-4.
O IP 6 quinases (IP 6 Ks) possuem uma enorme flexibilidade catalítico, convertendo IP 5 e IP 6 a PP-IP 4 e IP 7, respectivamente e, posteriormente, usando estes produtos como substratos, promover a geração de moléculas mais complexas 5,6 . Recentemente, uma segunda classe de enzimas gerando pirofosfato foi identificada na forma da proteína de levedura VIP 1 (também conhecido como PP-PI 5 K), que é capaz de converter IP 6 e IP 7 e 8 IP 7,8.
Pirofosfatos inositol regular muitas diferentes processos celulares, tais como a secreção de insulina, 9 de telômeros de comprimento 10,11, quimiotaxia, 12 de tráfico vesicular 13, 14 e homeostase do fosfato HIV-1 gag release 15. Dois mecanismos de ação têm sido propostos para esta classe de moléculas. Eles podem afetar a função celular por alostericamente interagir com proteínas específicas como a AKT 16. Alternativamente, o grupo pirofosfato pode doar um fosfato de pré-fosforilada proteínas 17. O enorme potencial deste campo de pesquisa é dificultada pela ausência de uma fonte comercial de pirofosfatos inositol, que está impedindo que muitos cientistas de estudar essas moléculas e esta modificação pós-translacional novo. Os métodos actualmente disponíveis para isolar pirofosfatos inositol exigem aparato cromatográfico sofisticado 18,19. Estes procedimentos utilizam condições ácidas que podem levar à degradação pirofosfato inositol 20 e, assim, para a recuperação pobres. Além disso, o incômodo procedimentos pós-coluna dessalinização restringir seu uso aos laboratórios especializados.
Neste estudo, descrevemos um método pouco exigente para a geração de isolamento e purificação dos produtos do IP 6-quinase e PP-IP 5-quinases reações. Este método foi possível pela capacidade de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver altamente fosforilada polifosfatos inositol 20. Após IP 6 K1 e PP-IP 5 reações enzimáticas K usando 6 IP como substrato, PAGE foi usada para separar o pirofosfatos gerada inositol, que foram posteriormente eluídos em água.
O uso de pirofosfato de inositol em bioquímica é severamente limitada pela indisponibilidade comercial de tais compostos ea pouca sensibilidade dos métodos de detecção existentes. A combinação de PAGE, que permite a separação de moléculas que possuem número diferente de grupos fosfato e Azul de Toluidina (Figura 1), um corante metacromática que se liga aos grupos fosfato, permite a fácil detecção de isoformas pyrophoshate inositol abrindo novos caminhos de pesquisa 20.
O uso da tecnologia descrita PAGE para purificar produtos pirofosfato inositol da reação enzimática realizada outby ou 6 IP K1 ou VIP1 é um método simples, econômico e confiável, que permite a produção de grandes quantidades de IP de alta qualidade 7. O método descrito acima não se limita à simples purificação do IP 7, mas pequenas modificações do protocolo descrito podem permitir a purificação de uma gama diferente de pirofosfatos inositol. Maior fosforilada isoformas pirofosfato inositol, contendo mais de oito grupos de fosfato pode ser detectada usando IP 7 ou diferentes quantidades de 6 IP como substrato 20,6. Estes pirofosfatos inositol pode ser detectado através do aumento da duração do processo de coloração e posteriormente purificada (seção 3.2). Além disso, o uso de 5 IP como substrato para a reação enzimática permitiria a purificação do PP-IP 5 e outras pirofosfatos inositol contendo um grupo hidroxila no anel inositol.
Em conclusão, este método permite pouco exigente para a purificação de confiança de quantidades miligrama de pirofosfatos inositol com instrumentos amplamente disponível, abrindo novos caminhos para esse campo de pesquisa emocionante.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a A. Riccio pelos comentários úteis e de ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica de financiamento (MRC) para a Unidade de Biologia Celular e por um Human Frontier Ciência Grant Program (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |