אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון
Summary
Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים אופטימיזציה<em> במבחנה</em> מסוגלים לזהות חוסר איזון החיסונית בנושאים בסיכון לפתח T1D assay.
Abstract
תקינה בתאי T (Tregs) הם מתווכים קריטית של סובלנות החיסונית העצמית אנטיגנים. בנוסף, הם הרגולטורים חיוני של התגובה החיסונית בעקבות זיהום. למרות המאמצים כדי לזהות סמן משטח ייחודי על Tregs, התכונה הייחודית רק הוא יכולתם לדכא את שגשוג ותפקוד של תאים T מפעיל. בעוד שברור כי רק מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש בהערכת תפקוד Treg אדם, זה הופך להיות בעייתי כאשר להערכת תוצאות חתך מחקרים שבהם תאים בריאים ותאים שבודדו נבדקים עם מחלות אוטואימוניות (כמו סוכרת מסוג 1-T1D) צורך כדי להשוות. קיימת שונות רבה בין מעבדות במספר וסוג של תאים המגיב T, טבע וכוח של גירוי, Treg: יחסי המגיב לבין מספר וסוג אנטיגן הצגת תאים (APC) בשימוש האדם מבחני חוץ גופית דיכוי. השתנות זו הופכת את ההשוואה בין המחקרים מדידת תפקוד Treg קשה. השדה Treg צריך assay דיכוי סטנדרטית זה יעבוד גם עם שני אנשים בריאים ואנשים עם מחלות אוטואימוניות. פיתחנו ב assay דיכוי במבחנה שמראה מעט מאוד התוך assay משונות גירוי של תאים T מבודד במתנדבים בריאים לעומת נבדקים עם הבסיס הרס אוטואימונית של הלבלב β-תאים. המטרה העיקרית של היצירה הזאת היא לתאר ב assay דיכוי במבחנה אנושי המאפשר השוואה בין קבוצות נושא שונות. בנוסף, assay הזה יש פוטנציאל להתוות הפסד קטן nTreg לתפקד צופים הפסד נוסף בעתיד, ובכך נושאים בזיהוי מי יכול להפיק תועלת מטיפול מניעתי המערכת החיסונית 1. להלן, אנו מספקים תיאור מעמיק של השלבים הכרוכים בהליך זה. אנו מקווים לתרום סטנדרטיזציה של ב assay דיכוי חוץ גופית המשמשת למדידת תפקוד Treg. בנוסף, אנו מציעים זה assay ככלי לזהות מצב של חוסר איזון מוקדם החיסונית סמן פונקציונלי פוטנציאל T1D.
Protocol
Discussion
כפי תכונה ייחודית רק Tregs, פונקציה מדכאים יש לבדוק באופן מהימן ואחיד בין הנושאים בשלבים שונים של התפתחות המחלה בתוך אותו בין מחקרים שונים. אנו מציעים פרטי assay דיכוי שפותחו במעבדה שלנו תרומתנו סטנדרטיזציה של assay זה. במחקר אופטימיזציה הנרחב שלנו, יש לנו קבעו כי גירוי תא T ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מקס McGee הלאומית למחקר המרכז לנוער Diabetesat לרפואה של וויסקונסין ומחקר ילדים של המכון ויסקונסין. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, או הכנה של כתב היד.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
