Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico
Summary
Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado<em> In vitro</em> Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.
Abstract
Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.
Protocol
Discussion
Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 hu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
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