Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.
L'adulto mesentere ratto saggio finestra angiogenesi è biologicamente appropriato ed è particolarmente adatta allo studio della germinazione angiogenesi in vivo [vedi documenti di revisione], che è la forma dominante di angiogenesi nei tumori umani e non-tessuti tumorali, come discusso in rassegna invitato carte 1,2. L'angiogenesi indotta nella parte membranosa mesenterica da intraperitoneale (ip) l'iniezione di un fattore pro-angiogenico può essere modulata per via sottocutanea (SC), per via endovenosa (ev) o orale (po) il trattamento con agenti modificatori di scelta. Ogni parte membranosa del mesentere è traslucido e incorniciato da tessuto adiposo, dandogli una finestra-come l'apparenza.
Il test ha le seguenti caratteristiche vantaggiose: (i) il tessuto di prova è nativamente vascolarizzato, anche se scarsamente, e poiché è estremamente sottile, la rete dei microvasi è praticamente a due dimensioni, che permette l'intera rete da valutare microscopicamente in situ; ( ii) in ratti adulti il tessuto di prova significativo manca l'angiogenesi fisiologica, che caratterizza la maggior parte dei tessuti adulti normali dei mammiferi, il grado di vascolarizzazione nativa, tuttavia, è correlata con l'età, come discusso in 1, (iii) il livello trascurabile di traumi indotti angiogenesi garantisce elevata sensibilità, (iv) il saggio riproduce la situazione clinica, in quanto l'angiogenesi, modulando la droga test sono somministrati per via sistemica e le risposte osservate riflette l'effetto netto di tutte le metabolici, cellulari, molecolari e le alterazioni indotte dal trattamento, (v) il test permette di valutazioni obiettive, quantitativi, le variabili imparziali di microvascolare estensione spaziale, la densità e la formazione di modello di rete, così come della capillare germinazione, consentendo così robuste analisi statistiche della dose-effetto e molecolare la struttura-attività, e (vi ) il test rivela con alta sensibilità agli effetti tossici o nocivi di trattamenti in termini di tasso di diminuzione fisiologica del peso corporeo, come ratti adulti crescere fortemente.
Mast-cellulo-mediata angiogenesi è stato dimostrato da questo test 3,4. Il modello dimostra un elevato livello di discriminazione in materia di dose-effetto e gli effetti misurati di via sistemica chimicamente o funzionalmente farmaci strettamente correlati e proteine, tra cui: (i) a basso dosaggio, metronomically somministrati chemioterapici standard di rendimento diversi, farmaco-specifici effetti (cioè, le attività di angiogenesi-soppressiva, neutro o angiogenesi-stimolante 5), (ii) naturale ferro-insaturi umano lattoferrina, che stimola VEGF-A-angiogenesi mediata 6 e naturale ferro-insaturi lattoferrina bovina, che inibisce VEGF-A- dell'angiogenesi mediata 7; e (iii) a basso peso molecolare frazioni eparina prodotta in vari modi 8,9. Inoltre, l'analisi è molto adatto a studi sugli effetti combinati di angiogenesi di agenti che sono somministrati per via sistemica in modo simultaneo o sequenziale.
L'idea di realizzare questo video origine dal compianto Dr. Judah Folkman quando ha visitato il nostro laboratorio e testimoniato la metodologia essere dimostrata.
Recensione carte (invitato) discutere e valutare il dosaggio
Norrby, K. Nei modelli in vivo di angiogenesi. J. cella. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, Drug test K. con modelli angiogenesi. Expert Opin. Droga. Sco. 3, 533-549 (2008).
Il dosaggio è stato introdotto nel 1986 3 e ha successivamente stato ulteriormente sviluppato e raffinato nel nostro laboratorio 7,10-12. Come discusso in documenti di revisione (invitato) 1, 2, il saggio mette a confronto anche con altri mammiferi test in vivo l'angiogenesi in particolare riguardo a caratteristiche importanti come il tessuto di prova degli adulti è nativamente vascolarizzato e privo di angiogenesi fisiologica; traumi minimi, se presente, viene inflitta il tessuto; variabili quantitative sono misurate veramente, che consente una valida analisi statistica per quanto riguarda dose-risposta e molecolare-attività degli studi; angiogenesi germinazione si verifica, che è predominante in tessuti normali e tumori, e dati sulla tossicità sono facilmente accumulato nei ratti che crescere fortemente fisiologicamente in età adulta. Caratteristiche svantaggiose possono includere il fatto che il saggio è relativamente molto tempo, soprattutto nel valutare il numero e la lunghezza dei singoli segmenti microvasi e germogli di microvasi, che non permette osservazioni real-time/serial, e che è poco adatto per i topi poiché molte finestre mesenterica nei topi mancanza microvasi potenziale genitore da cui può nascere nuovi capillari.
In tempo reale le osservazioni sono, tuttavia, ha permesso al microscopio intravitale dove sono aperte le finestre, ma esteriorizzato intatto mesenterica nell'arco di un microscopio a fase, mentre l'animale è anestetizzato, come discusso in 1.
Progressi significativi nella ricerca angiogenesi sono stati raggiunti negli ultimi decenni con modelli come la micropocket corneale, membrana corioallantoidea pulcino, e sc saggi spina Matrigel, che sono strumenti utili ma alla fine limitata. Future applicazioni cliniche di terapie anti-angiogenico e pro-angiogenici richiedono l'istituzione e la convalida dei più sensibili e biologicamente rilevanti, veramente quantitativa modelli pre-clinici, come quello descritto nel report corrente.
The authors have nothing to disclose.
Il sostegno finanziario per la maggior parte degli studi è stato fornito dalla svedese Medical Research Council (Grant 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)