生理的な血管新生とそれを欠いている正常な成体血管化哺乳動物の組織を研究するために使用される外科的介入にさらされていません:(i)の開始とテストエージェントの腹腔内投与後の血管新生の開発、との全身投与後の血管新生の(II)修正テストエージェントを選択した。
成体ラットの腸間膜のウィンドウの血管新生アッセイは、生物学的に適切であり、非常によく、in vivoで血管新生を萌芽の研究に適している、ヒト腫瘍および非腫瘍組織における血管新生の支配形態である、として招待レビューで議論[総説を参照してください]論文1,2。血管新生促進因子の腹腔内(ip)注射によって膜性腸間膜の部分に誘導される血管新生は、皮下(sc)、静脈内(iv)または経口(PO)の選択の変性剤による処理によって変調することができます。腸間膜の各膜部分は、それをウィンドウのような外観を与え、半透明や脂肪組織に囲まれています。
アッセイは、以下の有利な特徴を持っています:(i)のテストの組織は、まばらとはいえ、ネイティブ血管形成であり、そしてそれは非常に薄いので、微小血管のネットワークは、ネットワーク全体がその場で顕微鏡的に評価することができるようになる、実質的に二次元であり、( ⅱ)成熟ラットでの試験組織では、ほとんどの正常な成体哺乳動物の組織を特徴づける重要な生理的血 管新生を、欠けている、ネイティブ血管新生の程度は、、しかし、、1で説明した年齢と相関関係である。外傷誘発性の血管新生の(ⅲ)無視できるレベル高感度を確保、血管新生を調節する試験薬を全身投与し、反応はすべての代謝、携帯電話、および処理による分子変化の正味の効果を反映して観察しているとして(IV)アッセイは、臨床状態を複製すること、(v)アッセイは、それによって、用量効果と分子構造活性相関の堅牢な統計分析を可能にするだけでなく、発芽毛細血管のように、微小空間の拡張、密度、およびネットワークのパターン形成の客観的、定量的、公平な変数の評価を可能に、および(vi大人のラットは確実に成長するにつれて)アッセイは、生理学的な体重増加の減少率で、高感度での治療の毒性または有害な影響を明らかにする。
マスト細胞媒介血管新生は、最初にこのアッセイ3,4を用いて実証した。 (i)は、低用量、多様な、薬物特異的な効果をもたらすmetronomically投与標準化学療法:モデルには含め、投与量 – 効果関係と全身投与化学的または機能的に密接に関連する薬物と蛋白質の測定の効果に関する差別の高レベルを示しています( すなわち 、血管新生抑制、中性または血管新生を刺激する活動5)、(II)阻害VEGF -介した血管新生6を刺激する自然な鉄飽和ヒトラクトフェリン、、そして自然な鉄不飽和ウシラクトフェリン、VEGF -介する血管新生7、及び(iii)様々な手段8,9によって生成された低分子量ヘパリン画分。さらに、このアッセイは非常に同時または順番に全身投与されている薬剤の血管新生に対する複合効果の研究に適しています。
彼は我々の研究室を訪問し、例示されている方法論を目撃したときにこのビデオを作るというアイデアは、故ユダフォークマンに由来する。
レビュー論文は、(招待講演)議論と分析を鑑定
血管新生のin vivoモデルノルビ、K.。 J.セル。モル。メッド。 10、588〜612(2006)。
ノルビ、血管新生モデルとK.薬物検査。専門家Opin。薬。 Discov。 3、533〜549(2008)。
アッセイは、1986年3で導入され、連続してさらに発展し、我々の研究室7,10-12で洗練されています。としてレビュー論文(招待講演)1、2で説明したように、アッセイは、特に成人の試験組織として重要な機能に関してin vivo での血管新生アッセイでは他の哺乳類とよく比較してネイティブに血管化であり、生理的血 管新生を欠いている、最小限の外傷、もしあれば、です。真に定量的な変数が測定され、用量反応および分子活性研究に関する健全な統計的分析を可能にする;組織には強制正常組織と腫瘍で優位なされている、発芽血管新生は、発生、および毒性のデータが簡単に確実に成長ラットに蓄積されています生理的に成人インチそれはマウスのほとんどに適していることと、それはreal-time/serial観察を許可していないこと、不利な特徴は、個々の微小血管のセグメントと微小血管芽の数と長さを評価する場合は特にアッセイは、比較的時間がかかるという事実が含まれる場合がありますマウスでは多くの腸間膜のウィンドウが新たな毛細血管の起源となりうる潜在的な親の微小血管を欠いているので。
リアルタイム観測が、しかし、動物は麻酔のときに体外が無傷の腸間膜の窓が、1で述べたように、顕微鏡のステージ上からスプレイされている生体顕微鏡で有効になっています。
血管新生研究の著しい進歩は有用ですが、最終的に限られたツールであるような角膜micropocket、ニワトリ漿尿膜、およびSCマトリゲルプラグアッセイのようなモデルを用いて過去数十年間で達成されている。抗血管新生と血管新生促進療法の今後の臨床応用は、現在のレポートで説明したように、より敏感と生物学的に関連した、真に定量的な前臨床モデルの確立と検証を必要とする。
The authors have nothing to disclose.
ほとんどの研究のための財政支援は、スウェーデンの医学研究評議会(助成金5942)によって提供されていました。
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)