Normal vuxen vaskulariserad däggdjur som saknar fysiologiska angiogenes och som inte utsatts för kirurgiska ingrepp används för att studera: (i) inledande och utveckling av angiogenes efter intraperitoneal administrering av test-agenter, och (ii) ändring av angiogenes efter systemisk administrering av valda testet agenter.
Den vuxna råttor tarmkäx fönster angiogenes analysen är biologiskt lämpligt och är utomordentligt väl lämpad för studier av spirande angiogenes in vivo [se översiktsartiklar], som är den dominerande formen av angiogenes i mänskliga tumörer och icke-tumörvävnad, vilket diskuteras i inbjuden recension papper 1,2. Angiogenes induceras i membranös mesenteriala delar av intraperitoneal (ip) injektion av en pro-angiogena faktor kan moduleras genom subkutan (sc), intravenöst (iv) eller oralt (PO) behandling med modifierande ämnen val. Varje membranös del av krös är genomskinlig och ramas in av fettvävnad, ger det ett fönster-liknande utseende.
Analysen har följande fördelaktiga egenskaper: (i) testet vävnaden är native vaskulariserad, om än glest, och eftersom det är extremt tunn, är microvessel nätverket nästan tvådimensionella, vilket gör att hela nätverket som ska bedömas mikroskopiskt på plats; ( ii) hos vuxna råttor testet vävnaden saknar betydande fysiologiska angiogenes, som präglar de flesta normala vuxna däggdjursvävnader, graden av infödda vaskularisering är dock korrelerade med ålder, vilket diskuteras i 1, (iii) försumbar nivå av trauma-inducerad angiogenes garanterar hög känslighet, (iv) analysen replikerar den kliniska situationen, eftersom angiogenes-modulerande testa läkemedel ges systemiskt och svaren observerade speglar nettoeffekten av alla metaboliska, cellulära och molekylära förändringar som induceras av behandlingen, (v) analysen gör bedömningar av objektiva, kvantitativa, objektiva variabler av mikrovaskulära rumslig utsträckning, densitet och nätverk mönster bildas, samt kapillär groning, vilket möjliggör robusta statistiska analyser av dos-effekt och molekylär struktur-aktivitetssamband, samt (vi ) analysen avslöjar med hög känslighet för toxiska eller skadliga effekter av behandlingar i form av lägre frekvens av fysiologiska kroppen viktökning, som vuxna råttor växa stadigt.
Mast-cell-medierad angiogenes för första gången visat med hjälp av denna analys 3,4. Modellen visar på en hög nivå av diskriminering med avseende dosering och effekt och den uppmätta effekten av systemiskt administrerade kemiskt eller funktionellt närbesläktade droger och proteiner, inklusive: (i) med låg dos, metronomically administreras standard kemoterapeutika som ger olika, drog-specifika effekter (dvs, angiogenes-suppressiv, neutral eller angiogenes-stimulerande aktiviteter 5), (ii) naturligt järn-omättade mänskligt laktoferrin, som stimulerar VEGF-A-medierad angiogenes 6, och naturligt järn-omättade nötkreatur laktoferrin, som hämmar VEGF-A- medierad angiogenes 7, och (iii) med låg molekylvikt heparin fraktioner som produceras av olika medel 8,9. Dessutom är analysen mycket lämpade för studier av de kombinerade effekterna på angiogenes av läkemedel som är systemiskt i en samtidig eller sekventiell mode.
Tanken att göra den här filmen härstammar från slutet av Dr Juda Folkman när han besökte vårt laboratorium och bevittnade den metodik som demonstreras.
Översiktsartiklar (inbjuden) diskutera och bedöma analysen
Norrby, K. In vivo-modeller av angiogenes. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. drogtester med angiogenes modeller. Expert Opin. Läkemedel. Upptäckt. 3, 533-549 (2008).
Analysen infördes 1986 3 och har successivt vidareutvecklats och förfinats i vårt laboratorium 7,10-12. Som diskuterades i översiktsartiklar (inbjuden) 1, 2, jämför analysen bra med andra däggdjur in vivo angiogenes test när det gäller särskilt viktiga funktioner som vuxna testa vävnad är native vaskulariserad och saknar fysiologisk angiogenes, minimalt trauma, om någon, är tillfogat vävnaden, verkligen kvantitativa variabler mäts, vilket gör att ljudet statistisk analys av dos-respons-och molekylär-aktivitet studier, groning angiogenes sker, som dominerar i normal vävnad och tumörer, och toxicitetsdata anrikas lätt i råttor som växer kraftigt fysiologiskt i vuxen ålder. Ofördelaktigt funktioner kan omfatta det faktum att analysen är relativt tidskrävande, särskilt vid bedömningen av antal och längd enskilda microvessel segment och microvessel groddar, att den inte tillåter real-time/serial observationer, och att det knappast är lämplig för möss eftersom många mesenteriska fönster hos möss saknar potentiell förälder mikrokärl från vilket den nya kapillärer kan komma.
Real-time observationer är dock, vilket möjliggörs genom intravital mikroskopi där exteriorized men intakt mesenteriska fönster är utspärrade ut över ett mikroskop skede medan djuret bedövas, vilket diskuteras i 1.
Betydande framsteg inom angiogenes forskning har uppnåtts under de senaste decennierna med modeller som hornhinnan micropocket, chick chorioallantoic membran, och SC Matrigel analyser kontakten, som är användbara men som i slutändan begränsade verktyg. Framtida kliniska tillämpningar av anti-angiogena och pro-angiogena terapier det nödvändigt att upprätta och validering av mer känsliga och biologiskt relevanta, verkligen kvantitativa prekliniska modeller, såsom den som beskrivs i den aktuella rapporten.
The authors have nothing to disclose.
Ekonomiskt stöd för de flesta av studierna var från svenska Medicinska forskningsrådet (bidrag 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)