הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy
Summary
<em> In vivo</em> הדמיה פרוטוקול לפקח אקסונים חושית ראשוני הבאים למחוץ השורש הגבי מתואר. הנהלים לנצל רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו-thy1 YFP העכברים הטרנסגניים, ואת היתר הדמיה חוזרות ונשנות של התחדשות האקסון מעל 4 ס"מ ב PNS ואינטראקציות האקסון עם הממשק של מערכת העצבים המרכזית.
Abstract
אקסונים חושית העיקרי שנפגע פציעות שורש השדרה מצליחים להתחדש אל חוט השדרה, הגורם לכאב כרוני אובדן חושים קבע. התחדשות של הגב (DR) אקסונים שורש לתוך חוט השדרה הוא מנע בכניסה לאזור הגב שורש (דח), ממשק בין מערכת העצבים המרכזית ואת PNS. ההבנה שלנו את האירועים מולקולרית תאית למנוע התחדשות ב דח אינו שלם, בין השאר בשל שינויים מורכבים הקשורים פגיעה עצבית כבר להסיק ניתוחים שלאחר המוות. תהליכים תאיים דינמי, כגון התחדשות האקסון, נלמדים בצורה הטובה ביותר עם טכניקות ללכוד בזמן אמת אירועים עם תצפיות מרובות של כל חיה חיים. היכולת שלנו לפקח על נוירונים סדרתי in vivo גדל באופן דרמטי עקב חידושים מהפכניים באופטיקה ועכבר transgenics. כמה שורות של thy1-GFP העכברים הטרנסגניים, שבו תת נוירונים מסומנים בצבעי ניאון גנטית ברורה, היתר נוירונים בודדים להיות צילמו in vivo 1. עכברים אלו היו בשימוש נרחב בתחום ההדמיה vivo של השרירים והמוח 2-4 5-7, וגם סיפקו תובנות הרומן לתוך המנגנונים הפיזיולוגיים מנתח סטטי לא יכול להיות נפתרה. מחקרי הדמיה של נוירונים בחוט השדרה החיים החלו רק לאחרונה. ליכטמן ועמיתיו הראשון הפגינו ההיתכנות שלהם על ידי מעקב אחר נפצע הגבי (DC) אקסונים טור עם מיקרוסקופיה רחב בתחום 8,9. Multi-פוטון בתחום ההדמיה vivo של אקסונים ממוקם עמוק DC, microglia וכלי דם גם הושג 10. במהלך השנים האחרונות, יש לנו חלוץ ביישום בתחום ההדמיה vivo לפקח התחדשות של אקסונים DR שימוש רחב בתחום מיקרוסקופיה קו H של thy1-YFP עכברים. מחקרים אלו הובילו אותנו להשערה רומן על למה אקסונים DR מנועים התחדשות בתוך חוט השדרה 11.
בשורה של H-thy1 YFP עכברים, להבדיל YFP אקסונים + ממוקמים שטחית, אשר מאפשר אקסונים מספר לנטר בו זמנית. למדנו כי אקסונים DR להגיע דח הם צילמו המותני טוב יותר מאשר בחוט השדרה הצווארי. בדו"ח הנוכחי אנו מתארים מספר אסטרטגיות שמצאנו שימושי כדי להבטיח הדמיה לטווח ארוך וחזר מוצלח של אקסונים התחדשות DR. אלה כוללים שיטות לחסל אינטובציה חוזרים ונשנים הפרעה נשימתית, למזער ניתוח הקשורים מתח היווצרות צלקת, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה ויציבה ללא phototoxicity.
Protocol
Discussion
הדמיה DR התחדשות ישירות בעכברים החיים מאתגרת במיוחד, מכיוון שהיא דורשת laminectomy הגב כדי לפקח על צמיחה משמעותית האקסון פני שטח נרחב ואחריו מספר ניתוחים והוא הרדמה פולשנית הדמיה בפגישות הבאות. כמה אסטרטגיות סייעה להתגבר על אתגרים אלה. הדמיה ראשית, מוצלח נדרש צמצום תמותת ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד"ר אלן טסלר הערות ולעזור העריכה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NS062320.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
