Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie
Summary
Une<em> In vivo</em> Imagerie protocole à suivre axones sensoriels primaires suivantes écraser la racine dorsale est décrite. Les procédures utilisent à grand champ microscopie par fluorescence et Thy1-YFP souris transgéniques, et permettent une imagerie répétée de la régénération des axones plus de 4 cm dans le SNP et les interactions avec l'interface axone du SNC.
Abstract
Les axones sensoriels primaires blessés par des blessures profondes épinière ne parviennent pas à régénérer dans la moelle épinière, entraînant des douleurs chroniques et permanents perte sensorielle. Régénération de la racine dorsale (DR) axones dans la moelle épinière est empêché à la dorsale d'entrée de zone racine (DREZ), l'interface entre le SNC et du SNP. Notre compréhension des événements moléculaires et cellulaires qui empêchent la régénération au DREZ est incomplète, en partie parce que les changements complexes associées à des lésions nerveuses ont été déduites à partir d'analyses post-mortem. Dynamique des processus cellulaires, telles que la régénération des axones, sont les mieux étudiés avec les techniques que la capture en temps réel des événements avec de multiples observations de chaque animal vivant. Notre capacité à surveiller les neurones en série in vivo a augmenté de façon spectaculaire grâce à des innovations révolutionnaires en matière d'optique et de la souris transgénique. Plusieurs lignes de souris transgéniques Thy1-GFP, dans les sous-ensembles de neurones sont génétiquement distincts étiquetés dans des couleurs fluorescentes, permis de neurones individuels à imager in vivo 1. Ces souris ont été largement utilisés pour l'imagerie in vivo de muscle 2-4 et le cerveau 5-7, et ont fourni de nouvelles connaissances sur les mécanismes physiologiques qui analyse statique ne pouvait pas résolu. Les études d'imagerie des neurones dans la moelle épinière de vie n'ont commencé que récemment. Lichtman et ses collègues ont d'abord démontré leur faisabilité par le suivi des blessés dorsale colonne (CC) avec de larges axones microscopie à champ 8,9. Multi-photon dans l'imagerie in vivo des axones CC profondément positionnée, la microglie et les vaisseaux sanguins ont également été accomplis 10. Au cours des dernières années, nous avons été les premiers à appliquer l'imagerie in vivo pour contrôler la régénération des axones DR utilisant la microscopie à champ large et la ligne H du Thy1-YFP souris. Ces études nous ont conduit à une nouvelle hypothèse sur les raisons axones DR sont empêchés de régénération dans la moelle épinière 11.
Dans la ligne H du Thy1-YFP souris, distincte YFP axones + sont superficiellement placés, ce qui permet plusieurs axones être surveillés simultanément. Nous avons appris que les axones DR arrivant à DREZ sont mieux imager dans lombaire que dans la moelle épinière cervicale. Dans le présent rapport, nous décrivons plusieurs stratégies que nous avons trouvé utile d'assurer avec succès l'imagerie à long terme et répétées des axones régénérant DR. Il s'agit notamment de méthodes qui éliminent l'intubation et l'interruption répétée des voies respiratoires, de minimiser la chirurgie associée stress et la formation de cicatrices, et acquérir des images stables à haute résolution sans phototoxicité.
Protocol
Discussion
Imagerie DR directement dans la régénération de vie des souris est particulièrement difficile car il nécessite une laminectomie dorsale substantielle pour surveiller la croissance des axones sur une large zone suivie par plusieurs interventions chirurgicales effractives et anesthésiques à des séances d'imagerie ultérieurs. Plusieurs stratégies ont aidé à surmonter ces défis. Premièrement, l'imagerie réussie nécessaire de réduire la mortalité de la souris (environ 25%) en minimisant la durée de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Alan Tessler pour les commentaires et l'aide éditoriale. Ce travail a été soutenu par le NIH NS062320.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
References
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- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
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- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
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