Live avbildning av dorsala Axoner efter Rhizotomy
Summary
En<em> In vivo</em> Bildprotokoll att övervaka primära sensoriska axoner efter dorsala krossa beskrivs. De förfaranden som utnyttjar brett fält fluorescensmikroskopi och thy1-YFP transgena möss, och tillåta upprepad avbildning av Axon förnyelse över 4 cm i PNS och interaktion axon med gränssnittet i CNS.
Abstract
Den primära sensoriska axoner skadas av ryggmärgen rot skador misslyckas med att regenerera in i ryggmärgen, vilket leder till kronisk smärta och permanent känselbortfall. Förnyelse av dorsala (DR) axoner i ryggmärgen hindras på dorsala posten zon (DREZ), gränssnittet mellan CNS och PNS. Vår förståelse av de molekylära och cellulära händelser som hindrar förnyelse i DREZ är ofullständig, delvis på grund av komplexa förändringar i samband med nervskada har härledas från döden analyser. Dynamisk cellulära processer, såsom axonet förnyelse, är bäst studeras med metoder som fångar upp händelser i realtid med flera observationer av varje levande djur. Vår förmåga att övervaka nervceller serie in vivo har ökat dramatiskt på grund av revolutionerande innovationer inom optik och mus transgena. Flera rader av thy1-GFP transgena möss, där grupper av nervceller genetiskt märks i olika fluorescerande färger, tillåta enskilda nervceller som ska avbildas in vivo 1. Dessa möss har använts i stor utsträckning för in vivo avbildning av muskel 2-4 och hjärnan 5-7, och har gett nya insikter i fysiologiska mekanismer som statiska analyser inte kunnat lösas. Imaging studier av nervceller i levande ryggmärgen har först nyligen börjat. Lichtman och hans kollegor visade först deras genomförbarhet genom att spåra skadade dorsal kolumn (DC) axoner med brett fält mikroskopi 8,9. Multi-photon in vivo avbildning av djupt placerade DC axoner, har mikroglia och blodkärl också gjorts 10. Under de senaste åren har vi banat väg att tillämpa in vivo imaging att övervaka förnyelse av DR axoner med brett fält mikroskopi och H linje thy1-YFP möss. Dessa studier har lett oss till en roman hypotes om varför DR axoner hindras från att återskapa i ryggmärgen 11.
I H linje thy1-YFP möss, är separata YFP + axoner ytligt placerade, vilket gör att flera axoner som skall övervakas samtidigt. Vi har lärt oss att DR axoner anländer till DREZ bättre avbildas i ländryggen än i cervikala ryggmärgen. I föreliggande rapport beskriver vi flera strategier som vi har funnit användbara för att säkra framgångsrika långsiktiga och upprepade avbildning av regenererande DR axoner. Dessa inkluderar metoder som eliminerar upprepade intubation och respiratoriska avbrott, minimera kirurgi-associerade stress och ärrbildning, och förvärva stabila bilder med hög upplösning utan fototoxicitet.
Protocol
Discussion
Imaging DR förnyelse direkt i levande möss är särskilt utmanande eftersom det kräver en avsevärd rygg laminektomi att övervaka axon tillväxt över ett stort område följt av flera invasiva kirurgiska och anestesi i efterföljande bildbehandling sessioner. Flera strategier hjälpte till att övervinna dessa utmaningar. Först lyckade avbildning krävs att minska musen dödlighet (cirka 25%) genom att minimera den tid som anestesi och blödning, och genom noggrann post-op vård. Dödligheten minskade också med h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Alan Tessler för kommentarer och redaktionellt hjälp. Detta arbete stöddes av NIH NS062320.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
