קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em
Summary
כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.
Abstract
התאים האיקריוטים רבים ניתן לזהות הדרגתיים של אותות כימיים בסביבה שלהם ולהעביר בהתאם 1. הגירה זו תא מודרך הוא כאמור chemotaxis, שהוא חיוני עבור תאים שונים כדי לבצע את תפקידם כגון סחר של תאים חיסוניים דפוסים של תאים עצביים 2, 3. משפחה גדולה של חלבון ה-G-מצמידים קולטנים (GPCRs) מזהה פפטידים קטנים משתנה, המכונה chemokines, לכוון את נדידת תאים in vivo 4. המטרה הסופית של chemotaxis המחקר היא להבין כיצד החושים מכונות GPCR chemokine הדרגתיים בקרות אירועים איתות המובילים chemotaxis. לשם כך אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לפקח, בזמן אמת, ריכוזי spatiotemporal התנועה, chemoattractants תא שיפוע של chemoattractant, בתיווך GPCR הפעלה של חלבון ה-G-heterotrimeric, ואירועים איתות תאיים המעורבים chemotaxis של התאים האיקריוטים 5-8 . האורגניזם אוקריוטים פשוטה, discoideum Dictyostelium, מציג התנהגויות chemotaxic הדומים לאלה של לויקוציטים, וד ' discoideum היא מערכת מודל מפתח לחקר chemotaxis האיקריוטים. כפי חופשית חיים אמבות, ד תאים discoideum לחלק במדיום עשיר. עם רעב, תאים להזין תוכנית התפתחותית שבה הם מצטברים דרך המחנה בתיווך chemotaxis כדי ליצור מבנים multicullular. רכיבים רבים מעורבים chemotaxis למחנה זוהו ד discoideum. הכריכה של המחנה GPCR (cAR1) גורמת ניתוק של heterotrimeric G-חלבונים לתוך Gγ ואת יחידות משנה Gβγ 7, 9, 10. יחידות משנה Gβγ להפעיל ראס, אשר בתורו מפעיל PI3K, המרת PIP 2 לתוך PIP 3 על קרום התא 11-13. PIP 3 לשמש אתרי קישור החלבונים עם הומולוגיה pleckstrin (PH) תחומים, ובכך לגייס אלו חלבונים בקרום 14, 15. ההפעלה של רצפטורים cAR1 שולט גם עמותות הממברנה של PTEN, אשר dephosphorylates PIP PIP 2 ל 3 16, 17. מנגנונים מולקולריים הם באבולוציה ב chemotaxis chemokine GPCR בתיווך של תאים אנושיים כגון נויטרופילים 18. אנו מציגים מהשיטות הבאות לחקר chemotaxis ד discoideum תאים. 1. הכנת התאים המרכיבים chemotactic. 2. Chemotaxis הדמיה של תאים מפל cAMP. 3. ניטור הפעלת GPCR המושרה של heterotrimeric G-חלבון בתאים חיים אחת. 4. הדמיה chemoattractant-PIP מופעלות דינמי 3 תגובות בתאים חיים יחיד בזמן אמת. שיטות שפותחו שלנו הדמיה ניתן ליישם מחקר chemotaxis של לויקוציטים אנושיים.
Protocol
Discussion
תהליכי להגיע לשלב המוסמכת chemotactic של תאים
עבור סוג ד בר תאים discoideum, זה לוקח בערך 5 ~ 6 שעות פועם פיתוח בטמפרטורת החדר כדי לגרום להם לשלב היטב chemotactic מוסמך שבמהלכו התאים להציג מורפולוגיה הסלולר מקוטב היטב נדידת תאים מהיר (איור …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי קרן עירונית מ NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3′ kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
