כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium
במאמר זה
סיכום
תקציר
התאים האיקריוטים רבים ניתן לזהות הדרגתיים של אותות כימיים בסביבה שלהם ולהעביר בהתאם 1. הגירה זו תא מודרך הוא כאמור chemotaxis, שהוא חיוני עבור תאים שונים כדי לבצע את תפקידם כגון סחר של תאים חיסוניים דפוסים של תאים עצביים 2, 3. משפחה גדולה של חלבון ה-G-מצמידים קולטנים (GPCRs) מזהה פפטידים קטנים משתנה, המכונה chemokines, לכוון את נדידת תאים in vivo 4. המטרה הסופית של chemotaxis המחקר היא להבין כיצד החושים מכונות GPCR chemokine הדרגתיים בקרות אירועים איתות המובילים chemotaxis. לשם כך אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לפקח, בזמן אמת, ריכוזי spatiotemporal התנועה, chemoattractants תא שיפוע של chemoattractant, בתיווך GPCR הפעלה של חלבון ה-G-heterotrimeric, ואירועים איתות תאיים המעורבים chemotaxis של התאים האיקריוטים 5-8 . האורגניזם אוקריוטים פשוטה, discoideum Dictyostelium, מציג התנהגויות chemotaxic הדומים לאלה של לויקוציטים, וד ' discoideum היא מערכת מודל מפתח לחקר chemotaxis האיקריוטים. כפי חופשית חיים אמבות, ד תאים discoideum לחלק במדיום עשיר. עם רעב, תאים להזין תוכנית התפתחותית שבה הם מצטברים דרך המחנה בתיווך chemotaxis כדי ליצור מבנים multicullular. רכיבים רבים מעורבים chemotaxis למחנה זוהו ד discoideum. הכריכה של המחנה GPCR (cAR1) גורמת ניתוק של heterotrimeric G-חלבונים לתוך Gγ ואת יחידות משנה Gβγ 7, 9, 10. יחידות משנה Gβγ להפעיל ראס, אשר בתורו מפעיל PI3K, המרת PIP 2 לתוך PIP 3 על קרום התא 11-13. PIP 3 לשמש אתרי קישור החלבונים עם הומולוגיה pleckstrin (PH) תחומים, ובכך לגייס אלו חלבונים בקרום 14, 15. ההפעלה של רצפטורים cAR1 שולט גם עמותות הממברנה של PTEN, אשר dephosphorylates PIP PIP 2 ל 3 16, 17. מנגנונים מולקולריים הם באבולוציה ב chemotaxis chemokine GPCR בתיווך של תאים אנושיים כגון נויטרופילים 18. אנו מציגים מהשיטות הבאות לחקר chemotaxis ד discoideum תאים. 1. הכנת התאים המרכיבים chemotactic. 2. Chemotaxis הדמיה של תאים מפל cAMP. 3. ניטור הפעלת GPCR המושרה של heterotrimeric G-חלבון בתאים חיים אחת. 4. הדמיה chemoattractant-PIP מופעלות דינמי 3 תגובות בתאים חיים יחיד בזמן אמת. שיטות שפותחו שלנו הדמיה ניתן ליישם מחקר chemotaxis של לויקוציטים אנושיים.
פרוטוקול
1. הכנת התאים המוסמכת chemotactic של discoideum Dictyostelium
- כדי לייצר תאים ד discoideum כי הם chemotactic למחנה chemoattractant, תאים הקציר הגוברת D3-T מדיה עשירה מתרבות רועד ב 22 ° C.
- לשטוף את התאים פעמיים חיץ שאינו מזין התפתחותי (חיץ DB המכיל 5 mM Na 2 HPO 4, 5 מ"מ KH 2 PO 4, 2 מ"מ MgCl 2, 0.1 מ"מ CaCl 2).
- Re-להשעות תאים חיץ DB בצפיפות של 2x10 7 תאים /....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תהליכי להגיע לשלב המוסמכת chemotactic של תאים
עבור סוג ד בר תאים discoideum, זה לוקח בערך 5 ~ 6 שעות פועם פיתוח בטמפרטורת החדר כדי לגרום להם לשלב היטב chemotactic מוסמך שבמהלכו התאים להציג מורפולוגיה הסלולר מקוטב היטב נדידת תאים מהיר (איור 1). מספר גורמים, כמו מחנה ריכוז פועם, טמפרטורה, רקע גנטי שונה, עשוי להשפיע על תהליך ההגעה לשלב המוסמכת chemotactic. שיפוע מדריכים cAMP התאים לנוע לעבר מקור של המ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי קרן עירונית מ NIAID, NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| D3-T צמיחה מדיה | KD רפואי | ||
| קפאין | סיגמא | ||
| Latrunculin B | מולקולרית בדיקות | ||
| אלכסה 594 | מולקולרית בדיקות | ||
| cAMP | סיגמא | ||
| ChronTrol XT לתכנות טיימר | ChronTrol קורפ | ||
| Miniplus 3 peristaltic משאבה | Gilbson | ||
| פלטפורמה רוטרי שייקר | |||
| FemtoJet אספקת הלחץ microcapillary | Eppendorf | ||
| סינגל וארבע היטב Lab-Tek II coverglass לתאי | Nalge Nunc הבינלאומי | ||
| LSM 510 META או מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקבילה | Zeiss | 40X 1.3 NA או 60x 1.4 NA-DIC שמן תוכנית Neofluar אובייקטיבי עדשה | |
| אולימפוס X81 או שווה ערך | אולימפוס | דרוש 100x 1.47 NA העדשה TIRF אובייקטיבי |
מקורות
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
