成像摹蛋白偶联受体（GPCR）介导的信号，控制趋化粘菌</em
Summary
在这里，我们描述了详细的调查趋化活细胞成像的方法。我们目前的荧光显微方法来监测细胞迁移的信号事件的时空动态。测量信号的事件，使我们进一步了解如何GPCR的信令网实现了梯度感应的趋化因子和控制真核细胞的定向迁移。
Abstract
许多真核细胞中可以检测到在其环境中的化学信号的梯度迁移相应的 1 。这种引导细胞迁移被称为趋化作用，这是必不可少的各种细胞进行他们的功能，如免疫细胞和神经细胞2，3的图案贩运。一个大家族的G蛋白偶联受体（GPCRs的）检测变量，作为趋化因子的小分子肽， 直接在 体内 4细胞的迁移。趋化研究的最终目的是要了解一个GPCR的机械感官的趋化因子梯度和控制信号的事件，以趋化。为此，我们使用成像技术，实时监测，时空趋化因子，细胞运动的趋化因子梯度浓度，G蛋白偶联受体介导的异三聚体G蛋白的激活，细胞内的信号在 5-8真核细胞趋化涉及事件。简单的真核有机体，粘菌，显示chemotaxic行为类似白细胞和 D discoideum是一个重要的模型系统，为研究真核细胞趋化。由于自由生活的阿米巴，D discoideum细胞分裂丰富培养基。饥饿时，细胞进入一个发展的计划中，他们通过cAMP介导的趋化聚集，形成multicullular结构。趋化阵营中涉及的许多组件已经确定在 D discoideum。阵营的一个G蛋白偶联受体的结合（cAR1）诱导的异三聚体G蛋白解离成Gγ和Gβγ 亚基7，9，10 。 Gβγ亚基激活Ras，这反过来又激活的PI3K，转换成11-13细胞膜上的画中画画中画3 2。作为画中画3 pleckstrin同源性（PH值）域的蛋白质结合位点，从而招募这些蛋白膜14，15 。 cAR1受体的激活还控制PTEN基因， 这 3画中画画中画2月 16日，17去磷酸化膜 协会。是进化上保守的G蛋白偶联受体介导的趋化因子，如中性粒细胞18的人体细胞趋化的分子机制。我们提出了下面的方法研究D 的趋化discoideum细胞 。 1。制备趋化组件细胞。 2。成像的细胞趋化的一个营地梯度。 3。监测的异三聚体G蛋白G蛋白偶联受体在单个活细胞中的诱导活化。 4。在单个活细胞实时成像趋化触发动态画中画3反应。我们开发的成像方法可以应用于研究人类白细胞趋化作用。
Protocol
Discussion
深远的趋化细胞的主管阶段进程
对于野生型D. discoideum细胞，大约需要5〜6小时脉冲在室温下的发展，诱导他们进入一个良好的趋化主管的阶段，在此期间，细胞中显示良好的极化的细胞形态和细胞快速迁移（图1）。几个因素，如cAMP的浓度为脉冲，温度和不同的遗传背景，可能会影响深远的趋化主管阶段的过程。一个营地梯度引导细胞走向cAMP的来源，细胞迁移的趋化指定…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由国立卫生研究院从NIAID的，壁间基金的支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
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