可视登革病毒通过的Alexa Fluor标签
Summary
利用荧光的发展和成像技术，简单的方法，设计可视化早期病毒与细胞之间的相互作用的病毒，登革热的Alexa Fluor标签的进步。
Abstract
感染的结果，在病毒与细胞之间的相互作用的早期事件，可以有深远的影响。确定这种相互作用的影响因素可能会导致改善对疾病发病机理的认识，从而影响疫苗或治疗方案设计。因此，发展的方法来探测这种互动将是有益的的。在荧光团的发展1-3和成像技术，4最新进展，可以被利用来提高我们现有的知识对登革热的发病机制，从而铺平了道路，以减少每年发生登革热感染数以百万计的。
笼罩登革热病毒有一个外部的脚手架90包膜糖蛋白（e）保护核衣壳外壳的二聚体，其中包含一个正链RNA基因组的5组成。病毒表面上的相同的蛋白质亚基，从而可以与胺反应染料标记，并通过免疫荧光显微镜观察。在这里，我们提出了一个标签的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯染料直接溶解，取得了高度可行的病毒后，标签中的碳酸氢钠缓冲登革热病毒的简单方法。没有标准化程序的活病毒和现有的制造商的协议，对蛋白质的标签，通常需要染料在二甲基亚砜重组标签。二甲基亚砜的存在，即使在微量，可以阻止生产的病毒感染，也能诱导细胞的细胞毒作用 6 。排除使用在本议定书中的二甲基亚砜，从而降低了这种可能性。的Alexa Fluor染料具有优异的耐光性和低于常见的染料，如荧光素和罗丹明2，pH敏感，使他们的病毒对细胞的吸收和内体运输研究的理想。的Alexa Fluor染料的共轭不影响病毒特异性抗体，并在宿主细胞内 7公认的受体的识别标记的登革热病毒。这种方法可以在病毒学研究中的有用的应用程序。
Protocol
Discussion
虽然本报告中使用AF594染料，荧光团的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯系列广泛提供类似的标签化学。这可能会延长超越成像标签的应用。作为替代估计可兴奋和流式细胞仪机检测荧光团的标签程度的共聚焦显微镜，流式细胞仪可用于。
的Alexa Fluor染料小分子的反应，与游离氨基酸组，主要是精氨酸和赖氨酸9，一般向外面临的蛋白质残留。在我们的实验室，100μm的登革热病毒?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作已经由国家医学研究理事会，新加坡的资助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
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