のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化
Summary
蛍光体の開発とイメージング技術、ウイルスはウイルスと細胞の間で早期に相互作用を視覚化するために考案されたデング熱ののAlexa Fluor ®標識の簡単な方法の進歩を活用して。
Abstract
ウイルスと細胞の間の相互作用の初期段階でのイベントは、感染の結果に大きな影響を持つことができます。この相互作用に影響を与える要因を決定することは疾患の病因の理解の向上につながるため、ワクチンや治療薬の設計に影響を与える可能性がある。したがって、この相互作用を調べるための方法の開発は有用であろう。蛍光体の開発1-3とイメージング技術4の最近の進歩は、デング熱発症機序に関する現在の知識を向上させるため、毎年発生するデング熱感染数百万人を削減する道を開くために悪用される可能性があります。
包まれたデング熱ウイルスは、単一のプラス鎖RNAゲノム5を含むヌクレオカプシドシェルを、保護する90エンベロープ糖タンパク質（E）二量体で構成される外部足場を持っています。ウイルスの表面上に同一のタンパク質サブユニットは、このようにアミン反応性色素で標識し、免疫蛍光顕微鏡法によって可視化することができます。ここで、我々はAlexa Fluorスクシンイミジルエステル色素がラベルの後に非常に実行可能なウイルスをもたらした重炭酸ナトリウム緩衝液中で直接溶解でデング熱ウイルスの標識の簡単な方法を提示する。生きているウイルスやタンパク質標識は、通常、ジメチルスルホキシド中の染料の再構成を必要とするために、既存の製造業者のプロトコルのラベリングのための標準化された手順はありません。ジメチルスルホキシドの存在は、さらに微量で、ウイルスの増殖感染を遮断し、また細胞毒性6を誘発することができます。このプロトコルのジメチルスルホキシドの使用の排除は、このように、この可能性を減少させた。のAlexa Fluor ®色素は、優れた光安定性を持ち、細胞の取り込みとウイルスのエンドソーム輸送の研究に最適です、あまりpH感受性などフルオレセインやローダミン2のような一般的な染料、よりです。のAlexa Fluor ®色素のコンジュゲーションは、ウイルス特異的抗体と7宿主細胞内でのその推定受容体による標識デング熱ウイルスの認識に影響を与えなかった。このメソッドは、ウイルス学的研究に有用なアプリケーションを持つことができます。
Protocol
Discussion
AF594染料がこのレポートで使用されていますが、のAlexa Fluorスクシンイミジルエステルシリーズの蛍光体の広い範囲で同様のラベリングの化学で使用可能です。これは、イメージングを超えてラベリングアプリケーションを拡張することができます。フローサイトメトリーは、FACSの機械によって励起して検出できる蛍光物質のラベリングの度合いを推定するための共焦点顕微鏡の代替として?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立医学研究評議会、シンガポールによって資金を供給されています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
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