Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Summary

Este artigo apresenta um protocolo robusto para isolamento e cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos.

Abstract

Folículos pilosos sofrem crescimento ao longo da vida e do ciclo do cabelo é um processo bem controlado envolvendo a proliferação de células-tronco e tranquilidade. Bojo de cabelo é um nicho bem caracterizada por células-tronco adultas ^1. Este segmento da bainha externa da raiz contém um número de diferentes tipos de células estaminais, incluindo as células estaminais epiteliais, células ^{2 3} tronco dos melanócitos e da crista neural, como as células-tronco ^4-7. Folículos pilosos representam uma fonte acessível e rico para diferentes tipos de células-tronco humanas. Nós e outros isolaram células-tronco da crista neural (NCSCs) de folículos capilares humanos fetais e adultos ^4,5. Estas células estaminais humanas são etiquetas de retenção de células e são capazes de auto-renovação por divisão celular assimétrica in vitro. Expressam imaturos marcadores de células da crista neural mas não os marcadores de diferenciação. Nosso estudo mostrou perfil de expressão que eles compartilham um padrão de expressão de genes com semelhante murino pele imatura neural CREcélulas st. Eles exibem multipotência clonal que podem dar origem a linhagens de células miogênicas, melanocítica, e depois neuronal in vitro de cultura de células clonal única. As células diferenciadas não só adquirir linhagem marcadores específicos, mas também demonstram funções apropriadas em condições ex vivo. Além disso, estas mostram NCSCs potencial de diferenciação para linhagens mesenquimais. Diferenciadas de células neuronais pode persistir no cérebro do rato e reter marcadores de diferenciação neuronal. Tem sido demonstrado que folículo piloso derivado NCSCs pode ajudar recrescimento dos nervos, e que melhoram a função motora em murganhos transplantados com células estaminais após estas lesões da medula espinhal atravessa em ^8. Além disso, os nervos periféricos foram reparadas com enxertos de células-tronco ^9, e implantação de células precursoras derivadas da pele adjacentes aos nervos ciáticos esmagados resultou na remielinização ^10. Portanto, o folículo piloso / pele NCSCs derivados já mostraram resultados promissores para rterapia egenerative em modelos pré-clínicos.

Somática reprogramação celular para-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células mostrou um enorme potencial para a medicina regenerativa. No entanto, ainda há questões com muitas células iPS, em particular o efeito de longo prazo do oncogene / vírus integração e tumorigenicidade potencial das células-tronco pluripotentes não foram adequadamente tratadas. Ainda há muitos obstáculos a serem superados antes que as células iPS podem ser utilizados para a medicina regenerativa. Considerando que as células estaminais adultas são conhecidos por serem seguros e de terem sido utilizados clinicamente durante muitos anos, como o transplante de medula óssea. Muitos pacientes já se beneficiaram com o tratamento. Autólogo de células-tronco adultas são ainda preferenciais células para transplante. Portanto, as células adultas de fácil acesso e expansível-tronco em humanos de pele / cabelo folículos são uma fonte valiosa para a medicina regenerativa.

Protocol

1. Preparação de placas de cultura de tecidos Revestimento bem cada uma com suficiente poli-D-lisina (PDL) para cobrir o fundo do poço. Permitir que as placas a secar ao capuz. Depois de as cavidades são secos, enxaguar com água estéril, e aspirar. Permitir que as placas a secar ao capuz. Quando pêlo, seca com fibronectina (que foi dissolvido em água BioWhittaker noite a 37 ° C a uma concentração de 1 mg em 6 ml). Adicionar meio NCSC [DMEM/F12 95 ml, 1 ml Penn / Strep …

Discussion

Os métodos de isolamento e de cultura de células descritas são reprodutíveis e robusto. Geramos NCSCs de dezenas de indivíduos através de uma ampla faixa etária. Embora seja melhor para processar o tecido logo após a colheita de tecidos, descobrimos que os tecidos do couro cabeludo pode ser armazenado com segurança em meios de comunicação sobre o gelo para o transporte durante a noite com um impacto mínimo sobre a viabilidade celular.

É importante para o tratamento do tecido do …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063

Table 1.