Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes
Summary
Dit artikel presenteert een robuuste protocol voor isolatie en kweek van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes.
Abstract
Haarfollikels ondergaan permanente groei en haarcyclus een goed gecontroleerde proces met stamcelproliferatie en rust. Hair uitstulping is een goed gekarakteriseerd niche voor volwassen stamcellen 1. Dit segment van de buitenste wortelschacht omvat een aantal verschillende soorten stamcellen, inclusief epitheliale stamcellen 2, melanocyt stamcellen 3 en neurale stamcellen, zoals 4-7. Haarfollikels vertegenwoordigen een toegankelijke en rijke bron voor verschillende types van menselijke stamcellen. Wij en anderen hebben geïsoleerd neurale stamcellen (NCSCs) van menselijke foetale en volwassen haarzakjes 4,5. Deze menselijke stamcellen zijn label-behoud van cellen en zijn in staat zelf-vernieuwing door middel van asymmetrische celdeling in vitro. Ze drukken onvolwassen neurale cel markers, maar niet differentiatie markers. Onze expressie profilering studie toonde aan dat zij een vergelijkbaar gen expressie patroon te delen met de huid van muizen onvolwassen neurale creërenst cellen. Ze vertonen klonale multipotent die aanleiding kunnen aan myogene, melanocytaire, en neuronale cellijnen geven na in vitro klonale enkele cel cultuur. Gedifferentieerde cellen niet alleen het verwerven van afkomst-specifieke merkers, maar ook blijk geven van voldoende functies in ex vivo omstandigheden. Bovendien zijn deze NCSCs tonen differentiatie potentieel in de richting van mesenchymale geslachten. Gedifferentieerde neuronale cellen kunnen volharden in de hersenen van muizen en behouden van neuronale differentiatie markers. Het is aangetoond dat haarzakje kan afgeleid NCSCs zenuw hergroei helpen, en ze verbeteren functie in muizen getransplanteerd met deze stamcellen na doorsnijden ruggenmerg 8. Bovendien zijn perifere zenuwen gerepareerd met stamcel transplantaten 9 en implantatie van de huid afkomstige precursor cellen naast gemalen sciatic zenuwen heeft geleid tot remyelinisatie 10. Daarom hebben de haarfollikel / huid afgeleid NCSCs al veelbelovende resultaten opgeleverd voor regenerative therapie in preklinische modellen.
Somatische cellen herprogrammeren om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen heeft aangetoond een enorm potentieel voor regeneratieve geneeskunde. Er zijn echter nog steeds veel problemen met iPS cellen, in het bijzonder op de lange termijn effect van oncogen / virus-integratie en het potentieel tumorigeniciteit van pluripotente stamcellen zijn niet adequaat aangepakt. Er zijn nog veel hindernissen worden overwonnen voordat iPS cellen kunnen worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Dat de volwassen stamcellen zijn bekend als veilig en ze zijn klinisch gebruikt voor vele jaren, zoals beenmergtransplantatie. Veel patiënten hebben al geprofiteerd van de behandeling. Autologe volwassen stamcellen zijn nog steeds de voorkeur cellen voor transplantatie. Daarom is de gemakkelijk toegankelijke en uitbreidbaar volwassen stamcellen in de menselijke huid / haarzakjes zijn een waardevolle bron voor regeneratieve geneeskunde.
Protocol
Discussion
De cel beschreven isolatie en kweekwerkwijzen reproduceerbaar en robuust. We hebben gegenereerd NCSCs uit tientallen individuen over een breed leeftijdsbereik. Hoewel het het beste om het weefsel te verwerken direct na weefsel oogst, vonden we dat de hoofdhuid weefsels kunnen veilig worden opgeborgen in de media op ijs voor overnachting vervoer met een minimale impact op de levensvatbaarheid van de cellen.
Het is belangrijk om de hoofdhuid weefsel te behandelen met antibiotica en aseptische …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie R01AR054593 en R01AR054593-S1 aan Xu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 |
Table 1.
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
