Isolering och odling av neurala celler Crest härrör från mänskliga hårsäckar
Summary
I denna artikel presenteras en robust protokoll för isolering och odling av neurala celler crest stamceller från mänskliga hårsäckar.
Abstract
Hårsäckar genomgår livslång tillväxt och hår cykel är en väl kontrollerad process med spridning stamceller och stillhet. Hår bula är en väl karakteriserad nisch för adulta stamceller 1. Detta segment av den yttre rotskidan innehåller ett antal olika typer av stamceller, inklusive epitelstamceller 2, melanocytstimulerande stamceller 3 och neurallisten som stamceller 4-7. Hårsäckar representerar en tillgänglig och rik källa för olika typer av mänskliga stamceller. Vi och andra har isolerat neurala celler crest stamceller (NCSCs) från humana foster och vuxna hårsäckar 4,5. Dessa mänskliga stamceller är etikett-hållande celler och kan självförnyelse genom asymmetrisk celldelning in vitro. De uttrycker omogna neurala markörer crest celler men inte differentieringsmarkörer. Vår expression profiling visade att de delar ett liknande mönster genuttryck med murin hud omogna neurala skapast celler. De uppvisar klonal multipotens som kan ge upphov till myogena, melanocytisk och neuronala cellinjer efter in vitro klonal enda cellodling. Differentierade celler inte bara skaffa härstamning specifika markörer utan också visa lämpliga funktioner i ex vivo förhållanden. Dessutom är dessa NCSCs visar differentiering potential mot mesenkymala linjerna. Differentierade neuronala celler kan kvarstå i mushjärna och behålla neuronala differentieringsmarkörer. Det har visats att hårsäcken härledda NCSCs kan hjälpa nerv återväxt, och de förbättrar motorns funktion i möss transplanterade med dessa stamceller efter transecting ryggmärgsskada 8. Dessutom har perifera nerver reparerats med transplantat stamceller 9, och implantation av hud-härledda prekursorceller intill krossade ischiasnerver har resulterat i remyelinisering 10. Därför har hårsäcken / skinn som härrör NCSCs redan visat lovande resultat för regenerative terapi i prekliniska modeller.
Somatisk omprogrammering till inducerade (IPS) pluripotenta stamceller har visat enorm potential för regenerativ medicin. Men det finns fortfarande många frågor med iPS-celler, särskilt på lång sikt effekten av onkogen / virus integration och potentiella tumorigenicitet av pluripotenta stamceller har inte tillräckligt uppmärksammar. Det finns fortfarande många hinder att övervinna innan iPS-celler kan användas för regenerativ medicin. De adulta stamceller är kända för att vara säkra och de har använts kliniskt under många år, såsom benmärgstransplantation. Många patienter har redan dragit nytta av behandlingen. Autologa adulta stamceller fortfarande föredragna celler för transplantation. Därför lättillgänglig och expanderbar adulta stamceller i humana hud / hår folliklar är en värdefull källa för regenerativ medicin.
Protocol
Discussion
Cell isolering och odling beskrivna metoder är reproducerbara och robust. Vi har skapat NCSCs från dussintals individer inom ett brett åldersintervall. Även om det är bäst att behandla vävnaden direkt efter vävnad skörd, fann vi att hårbotten vävnad säkert kan förvaras i media på is över natten transporter med minimal påverkan på cellviabilitet.
Det är viktigt att behandla hårbotten vävnad med antibiotika och använda aseptisk teknik under hårsäcken isolering för att u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH bidrag R01AR054593 och R01AR054593-S1 till Xu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 |
Table 1.
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
