كشف وGenogrouping من Noroviruses من براز الأطفال وذلك في خطوة واحدة Taqman RT-PCR
Summary
وخطوة واحدة RT-PCR فحص للكشف وتحديد genogroup من العزلات نوروفيروس من براز الأطفال، والتي تستخدم الاشعال وتحقيقات TaqMan محددة لإطار القراءة المفتوح 1 (ORF1)-ORF2 منطقة تقاطع، وهي المنطقة الأكثر حفظها من الجينوم نوروفيروس هو وصفها. وترد تفاصيل وغير التجاري، واستخراج الحمض النووي الريبي طريقة فعالة من حيث التكلفة.
Abstract
Noroviruses (NoVs) هي السبب الرئيسي لتفشي التهاب المعدة والأمعاء الحاد متفرقة في جميع أنحاء العالم في البشر من جميع الأعمار. فهي سبب مهم من المستشفيات في الأطفال الذين يعانون من تأثير على الصحة العامة مماثلة لتلك التي من الفيروس العجلي. NoVs هي فيروسات الحمض النووي الريبي من التنوع الجيني الكبير، وهناك مظهر المستمر للسلالات جديدة. يتم التعرف على خمسة genogroups؛ GI وGII مع المورثات الخاصة بهم العديد من الأنواع الفرعية وأهمها لعدوى الإنسان. ومع ذلك، فإن تشخيص هذه المورثات 2 لا تزال مشكلة، وتأخير التشخيص والعلاج. 1، 2، 3
لاستخراج الحمض النووي الريبي من عينات البراز الأسلوب الأكثر استخداما هو QIAmp عدة RNA الفيروسي التجارية من QIAGEN. هذا الأسلوب يجمع بين خصائص ملزم من السيليكا غشاء هلام، المخازن المؤقتة التي RNases مراقبة وتوفير الربط الأمثل من الحمض النووي الريبي إلى العمود مع سرعة microspin. هذه طريقة بسيطة وسريعة وموثوق بها وغير كار العبوات الناسفة في بعض الخطوات التي ترد تفاصيلها في الوصف المقدم من قبل الشركة المصنعة.
نوروفيروس هو الثاني فقط لفيروس الروتا هو السبب الأكثر شيوعا للإسهال. وينبغي تشخيص نوروفيروس تكون متاحة في جميع الدراسات حول التسبب في الإسهال، وكذلك في تفشي حالات الإسهال أو الفردية. في الوقت الحاضر يقتصر التشخيص لكن نوروفيروس إلى مراكز قليلة فقط نظرا لعدم وجود طرق بسيطة للتشخيص. هذا التشخيص والعلاج التأخير 1، 2، 3. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك بسبب تكاليف النقل والتنظيم من مخازن للتآكل داخل البلدان وبينها استخدام هذه المجموعات المصنعة يطرح مشاكل لوجستية. ونتيجة لذلك، في هذا البروتوكول وصفنا 1، اقتصادية بديلة، في منزل أسلوب الذي يقوم على أساس الطفرة الأصلي وآخرون. طريقة (4) الذي يستخدم خصائص الحمض النووي ملزم من جسيمات السيليكا جنبا إلى جنب مع خصائص مضادة للnuclease من ثيوسيانات guanidinium .
<p class=وقد وضعت "jove_content"> لكشف وgenogrouping (GI وGII) من العزلات NoVs من عينات البراز، عدة RT-PCR البروتوكولات التي تستخدم أهداف مختلفة. الإجماع هو أن RT-PCR باستخدام TaqMan كيمياء سيكون أفضل تقنية جزيئية للتشخيص، لأنه يجمع بين حساسية عالية، والنوعية، وإعادة الإنتاج مع إنتاجية عالية وسهولة الاستخدام. هنا نحن تصف فحص استهداف المفتوحة القراءة إطار 1 (ORF1) منطقة تقاطع ORF2، المنطقة الأكثر حفظها من الجينوم نوفمبر، وبالتالي الأكثر ملاءمة لتشخيص المرض. لمزيد من التحليل الجيني التقليدي RT-PCR الذي يستهدف متغير بدرجة كبيرة N-محطة قذيفة من بروتين رئيسي من 5 قفيصة (المنطقة ج) استخدام الاشعال ووصف في الأصل من قبل كوجيما وآخرون. وترد تفاصيل. التسلسل للمنتج PCR من PCR التقليدية تمكن من التفريق بين الأنماط الجينية التابعة لمعهد جوته وgenogroups GII.Protocol
Discussion
باستخدام الاقتصادية في منزل طريقة لعزل الحمض النووي من عينات البراز، ونحن الحصول على نتائج متساوية كما هو الحال مع تجارية عدة QIAmp RNA الفيروسي من QIAGEN، وجنبا إلى جنب مع TaqMan RT-PCR وضعت في مختبر لدينا يمكننا الكشف عن مجموعة واسعة من نوفمبر المورثات تنتمي إلى الجهاز الهضمي و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الفيروسة الكأسية مختبر المركز الوطني لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) للهدية نوع من ايجابيات وتحكم لنوفمبر، ومختبرات لكلية الصحة العامة في جامعة جونز هوبكنز لتوفير الكواشف.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
