Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Summary

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

Abstract

Os norovírus (NoVs) são a principal causa de surtos de gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo em seres humanos de todas as idades. Eles são importante causa de hospitalizações em crianças com impacto na saúde pública semelhante à de Rotavirus. NoVs são vírus de RNA de grande diversidade genética e há uma aparência contínua de novas estirpes. Cinco genogrupos são reconhecidos; GI e GII com seus genótipos e subtipos muitos sendo o mais importante para a infecção humana. No entanto, o diagnóstico de dois genótipos continua a ser problemática, retardando o diagnóstico e tratamento. ^{1, 2, 3}

Para extração de RNA a partir de amostras de fezes, o método mais comumente usado é o QIAmp kit RNA Viral comercial da Qiagen. Este método combina as propriedades de ligação de uma membrana de gel de sílica, buffers que as RNases de controlo e proporcionam ligação óptimas de ARN para a coluna, juntamente com a velocidade de MicroSpin. Este método é simples, rápido e confiável e é carrIED em alguns passos que são detalhados na descrição fornecida pelo fabricante.

O norovírus é apenas a segunda rotavírus como a causa mais comum de diarréia. Diagnóstico norovírus devem estar disponíveis em todos os estudos sobre a patogênese da diarréia, bem como em surtos ou casos de diarréia individuais. Actualmente no entanto diagnóstico norovírus é restrita a poucos centros devido à falta de métodos simples de diagnóstico. Este diagnóstico e tratamento atrasos ^{1, 2, 3.} Além disso, devido aos custos de transporte e regulamentado de buffers corrosivos dentro e entre países o uso desses kits manufaturados coloca problemas logísticos. Como resultado, neste protocolo descrevemos uma alternativa, económica, método in-house que se baseia na lança inicial et al. Método ⁴ que utiliza as propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica, juntamente com as propriedades anti-nuclease de tiocianato de guanidínio .

<p class="Jove_content"> Para a detecção e genogrouping (GI e GII) de isolados NoVs de amostras de fezes, vários protocolos de RT-PCR utilizando diferentes alvos têm sido desenvolvidos. O consenso é que uma RT-PCR utilizando TaqMan química seria a melhor técnica molecular para o diagnóstico, porque combina alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade com alto rendimento e facilidade de utilização. Descrevemos aqui um ensaio de segmentação da estrutura de leitura aberta 1 (ORF1) região de junção-ORF2; a região mais conservada do genoma NoV e, portanto, mais adequado para o diagnóstico. Para a análise genética mais uma RT-PCR convencional que tem como alvo o altamente variável N-terminal a partir de casca-a principal proteína da cápside (Região C) utilizando iniciadores originalmente descritos por Kojima et ai. ⁵ é detalhado. A sequenciação do produto de PCR a partir do PCR convencional permite a diferenciação de genótipos pertencentes ao GI e genogrupos GII.

Protocol

1. As amostras de fezes As amostras de fezes devem ser armazenadas congeladas a preservar o RNA. Para fazer uma suspensão a 10% fecal, tomar aproximadamente 0,1 g de amostra de fezes descongeladas e completar a 1 ml com PBS. Alíquota em 200 ul para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Armazenar as alíquotas a -70 ° C. Descongelar e centrifugar alíquotas a 4.000 g durante 10 min antes da utilização na extracção. 2. Preparação…

Discussion

Usando o económico in-house método para isolar o ácido nucleico a partir de amostras de fezes, obtém-se resultados iguais como com o comercial QIAmp de RNA viral kit de Qiagen, e em conjunto com o TaqMan RT-PCR desenvolvido no nosso laboratório que pode detectar uma ampla gama de NoV genótipos pertencentes ao GI e GII genogrupo. Uma publicação recente da região C protocolo relataram taxas de genotipagem de 78% ^6. Uma vez que a diversidade das cepas contemporâneas Nov tem vindo a aumentar nos anos an…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100