采用TaqMan从儿童凳诺如病毒的检测和Genogrouping一步法RT-PCR技术
Summary
一个一步法RT-PCR方法检测检测和孩子的大便，，利用引物和的TaqMan探针的开放阅读框（ORF1基因）的病毒ORF2交界地区，对诺沃克类病毒基因组中最保守的地区是特定genogroup诺沃克病毒分离鉴定描述。详述一个非商业化，具有成本效益的RNA提取方法。
Abstract
诺如病毒（NoVs）是在全球所有年龄的人散发性急性胃肠炎暴发的首要原因。他们是在与公共健康的影响类似于轮状病毒的儿童住院的重要原因。 NoVs RNA病毒的伟大的遗传多样性，并有不断涌现的新菌株。五genogroups是与他们的许多基因型和亚型的人类感染的最重要的认可; GI和GII。然而，这两个品种的诊断仍然是个问题，延误诊断和治疗。1，2，3
最常用的方法是从粪便标本中提取的RNA病毒RNA的QIAmp Qiagen公司的商业套件。这种方法结合硅胶膜结合特性，缓冲区控制核糖核酸酶和列提供最佳的RNA结合到一起的microspin速度。这种方法简单，快速和可靠的，是卡尔灭蝇灯，一个由制造商提供的说明中详述的几个步骤。
诺沃克病毒是仅次于轮状病毒腹泻的最常见的原因。诺沃克病毒感染的诊断应该是在腹泻的发病机制研究，以及在疫情或个别腹泻病例。但诺罗病毒的诊断，目前的限制，只是由于缺乏简单的诊断方法的几个中心。这延误诊断和治疗1，2，3。此外，由于国家内部和国家之间的成本和监管运输腐蚀性缓冲区使用这些生产工具包构成的后勤问题。因此，在这个协议中，我们描述的替代，经济，内部方法，这是基于对原有的繁荣等。方法4二氧化硅粒子的核酸结合特性一起使用异硫氰酸胍的抗核酸的性质。
<p class=从粪便标本中，几个RT-PCR技术协议，利用不同的目标NoVs株的检测和genogrouping（GI和GII）“jove_content”>已经制定出来。的共识是，RT-PCR技术使用的TaqMan化学将是最好的分子诊断技术，因为它结合了高吞吐量和易用性，灵敏度高，特异性和重复性。在这里，我们描述了一个检测目标的开放阅读框（ORF1基因）的ORF2交界地区; 11月基因组中最保守的地区，因此最适合用于诊断。为进一步的遗传分析传统的RT-PCR技术，针对的主要蛋白质衣壳（C区）引物最初是由小岛等。5高度可变的N-末端壳详细介绍。从常规PCR测序的PCR产物，使属于GI和GII的genogroups基因型分化。Protocol
Discussion
我们使用内部方法从粪便标本中分离核酸的经济，商业QIAmp病毒RNA试剂盒Qiagen公司获得平等的结果，并连同荧光定量RT-PCR技术在我们的实验室开发的，我们可以检测到了11月的广泛属于GI和GII的genogroup的基因型。最近出版的C区协议的基因分型率78％6。往年由于当代十一月株的多样性已在增加，成功率将取决于被测试的样品中地区ç引物的错配。常规诊断法是有用的，因为它消除了放大后的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
笔者想感谢月的标准和控制阳性礼物的国家杯状病毒实验室为疾病控制和预防中心（CDC），并提供试剂在约翰霍普金斯大学公共卫生学院的实验室。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
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