Detektion og Genogrouping af norovira fra børne Taburetter Ved Taqman Et-trins RT-PCR

Summary

En One-Step RT-PCR assay til detektion og genogruppe identifikation af norovirus isolater fra børns afføring, som udnytter primere og TaqMan prober specifikke for den åbne læseramme 1 (ORF1)-ORF2 forbindelsesregionen, mest konserverede region i norovirus genomet er beskrevet. En ikke-kommercielle, omkostningseffektive RNA ekstraktion metode er nærmere beskrevet.

Abstract

Norovira (NoVs) er den hyppigste årsag til udbrud af sporadisk akut gastroenteritis på verdensplan i mennesker i alle aldre. De er vigtig årsag til indlæggelser hos børn med en indvirkning på folkesundheden, der svarer til Rotavirus. NoVs er RNA-vira med stor genetisk diversitet, og der er en kontinuerlig forekomst af nye stammer. Fem genogrupper indregnes, GI og GII med deres mange genotyper og subtyper er det vigtigste for smitte til mennesker. Imidlertid diagnosen af disse to genotyper stadig problematisk, forsinke diagnose og behandling. ^{1, 2, 3}

For RNA-ekstraktion fra fæcesprøver den mest almindeligt anvendte fremgangsmåde er QIAmp virale RNA kommercielt kit fra Qiagen. Denne fremgangsmåde kombinerer bindingsegenskaberne af silicagel membran, buffere, der styrer RNaser og giver optimal binding af RNA til søjlen sammen med hastigheden af ​​MicroSpin. Denne metode er enkel, hurtig og pålidelig og er CarrIED ud i et par trin, der er beskrevet i beskrivelsen leveres af producenten.

Norovirus er kun overgået af rotavirus som den mest almindelige årsag til diarré. Norovirus diagnosen bør være tilgængelige i alle undersøgelser af patogenese af diarré samt i udbrud eller individuelle diarré sager. På nuværende tidspunkt er imidlertid norovirus diagnose er begrænset til nogle få centre på grund af mangel af simple metoder til diagnosticering. Dette forsinker diagnose og behandling ^{1, 2, 3.} Desuden bruger på grund af omkostninger og reguleret transport af ætsende buffere i og mellem landene af disse fremstillede kits udgør logistiske problemer. Som et resultat har vi i denne protokol beskriver en alternativ økonomisk, in-house metode, som er baseret på den oprindelige Boom et al. Fremgangsmåde ⁴ som anvender de nucleinsyrebindende egenskaber silicapartikler sammen med anti-nuklease egenskaber guanidiniumthiocyanat .

<p class="Jove_content"> For påvisning og genogrouping (GI og GII) af NoVs isolater fra fæcesprøver, flere RT-PCR-protokoller benytter forskellige mål er blevet udviklet. Enighed om, at en RT-PCR ved hjælp af TaqMan kemi ville være det bedste molekylære teknik til diagnose, fordi den kombinerer høj følsomhed, specificitet og reproducerbarhed med høj gennemløb og brugervenlighed. Her beskriver vi en assay målretning den åbne læseramme 1 (ORF1)-ORF2 forbindelsesregionen, mest konserverede region i nov genomet og dermed mest egnet til diagnose. For yderligere genetisk analyse af en konventionel RT-PCR, som er rettet mod den stærkt variable N-terminal-skallen fra den store protein capsid (region C) under anvendelse af primere der oprindeligt er beskrevet af Kojima et al. ⁵ er nærmere. Sekventering af PCR-produktet fra konventionel PCR muliggør differentiering af genotyper, der tilhører GI og GII genogrupper.

Protocol

1. Afføringsprøver Afføringsprøver skal opbevares nedfrosset til at bevare RNA. At gøre en 10% fækalt suspension tage ca 0,1 g optøet afføringsprøve og afslutte til 1 ml med PBS. Alikvot på 200 ul at undgå gentagen frysning og optøning. Opbevares i aliquoter ved -70 ° C. Optø og centrifugeres alikvoter ved 4000 g i 10 min før anvendelse i ekstraktionen. 2. Fremstilling af siliciumdioxidovertrukket partikler til Ekstraktion med guanidin og Sil…

Discussion

Ved hjælp af økonomiske i huset fremgangsmåde til isolering af nukleinsyre fra afføringsprøver, vi opnå samme resultater som med det kommercielle QIAmp Viral RNA-kittet fra Qiagen, og sammen med TaqMan RT-PCR udviklet i vores laboratorium har vi kan detektere et bredt område af NOV genotyper tilhører GI og GII genogruppe. En nylig offentliggørelse af regionens C-protokollen rapporteret genotypebestemmelse satser på 78% ^6. Siden mangfoldigheden af ​​moderne nov stammer har været stigende i de fo…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100