Détection et Genogrouping des norovirus dans les selles des enfants en Taqman en une seule étape de RT-PCR

Summary

Un One-Step RT-PCR pour la détection et l'identification génogroupe des isolats de norovirus dans les selles des enfants, qui utilise des amorces et des sondes TaqMan spécifiques au cadre de lecture ouvert 1 (ORF1)-ORF2 région de jonction, la région la plus conservée du génome de Norovirus est décrit. Un non-commerciale, rentable méthode d'extraction d'ARN est détaillé.

Abstract

Les norovirus (NoV) sont la principale cause des épidémies de gastro-entérite aiguë sporadique dans le monde entier chez les humains de tous âges. Ils sont cause importante d'hospitalisation chez les enfants ayant un impact de santé publique semblable à celle de rotavirus. NoV sont des virus à ARN de grande diversité génétique et il ya un aspect continu de nouvelles souches. Cinq génogroupes sont reconnus; GI et GII avec leurs nombreux génotypes et sous-types étant le plus important pour l'infection humaine. Cependant, le diagnostic de ces deux génotypes reste problématique, ce qui retarde le diagnostic et le traitement. ^{1, 2, 3}

Pour l'extraction d'ARN à partir d'échantillons de selles de la méthode la plus couramment utilisée est le kit RNA viral QIAmp commercial de Qiagen. Ce procédé combine les propriétés de liaison d'une membrane de gel de silice, les tampons qui ARNases contrôle et fournir liaison optimales de l'ARN à la colonne ensemble avec la vitesse de MicroSpin. Cette méthode est simple, rapide et fiable et est carrIed dans quelques étapes qui sont détaillées dans la description fournie par le fabricant.

Norovirus est la deuxième à rotavirus est la cause la plus fréquente de la diarrhée. Diagnostic norovirus devrait être disponible dans toutes les études sur la pathogenèse de la diarrhée ainsi que dans les foyers ou les cas de diarrhée individuels. À l'heure actuelle le diagnostic norovirus mais est limitée à seulement quelques centres en raison de l'absence de méthodes simples de diagnostic. Ce diagnostic et le traitement des retards ^{1, 2, 3.} En outre, en raison des coûts de transport et réglementé de tampons corrosifs à l'intérieur et entre les pays l'utilisation de ces kits manufacturés pose des problèmes logistiques. En conséquence, dans ce protocole, nous décrivons une alternative, économique, en interne la méthode qui est basée sur la bôme d'origine et al. La méthode ⁴ qui utilise les propriétés d'acides nucléiques de liaison de particules de silice ainsi que les propriétés anti-nucléase de thiocyanate de guanidinium .

<p class="Jove_content"> Pour la détection et la genogrouping (GI et GII) des isolats de NoV échantillons de selles, de plusieurs protocoles de RT-PCR en utilisant des objectifs différents ont été développés. Le consensus est que le RT-PCR en utilisant la chimie TaqMan serait la meilleure technique moléculaire pour le diagnostic, car il combine une grande sensibilité, la spécificité et la reproductibilité avec un débit élevé et la facilité d'utilisation. On décrit ici un dosage cible de la région de lecture ouvert trame 1 (ORF1) de jonction-ORF2; la région la plus conservée du génome de NoV et donc le plus approprié pour le diagnostic. Pour l'analyse génétique en outre une RT-PCR conventionnelle qui vise le très variable N-terminal-shell de la protéine majeure de la capside (région C) en utilisant des amorces décrites à l'origine par Kojima et al. ⁵ est détaillé. Le séquençage du produit de PCR de la PCR conventionnelle permet la différenciation des génotypes appartenant à la GI et GII génogroupes.

Protocol

1. Des échantillons de selles Des échantillons de selles doivent être congelés afin de préserver l'ARN. Pour faire une suspension à 10% fécale, prenez environ 0,1 g de l'échantillon de selles décongelées et compléter à 1 ml avec du PBS. Aliquoter dans 200 ul d'éviter les cycles de gel et de dégel. Entreposer les aliquotes à -70 ° C. Décongeler et centrifuger à 4000 g aliquotes pendant 10 min avant de l'utiliser dans l'extraction. <p class="jo…

Discussion

Utilisation de l'économique dans la maison-méthode pour isoler l'acide nucléique à partir d'échantillons de selles, on obtient des résultats égaux avec le commercial QIAmp virale ARN kit de Qiagen, et avec le TaqMan RT-PCR développée dans notre laboratoire, nous permet de détecter un large éventail de NoV génotypes appartenant à la GI et GII génogroupe. Une publication récente du protocole de la région C ont signalé des taux de génotypage de 78% ^6. Depuis la diversité des souche…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100