צעד אחד RT-PCR assay לגילוי וזיהוי genogroup של מבודד norovirus מ כיסאות ילדים, אשר מנצל primers ו בדיקות TaqMan ספציפיים מסגרת קריאה פתוחה 1 (ORF1)-ORF2 באזור צומת, האזור משומר רוב הגנום norovirus הוא תיאר. לא מסחרי, חסכונית שיטת מיצוי RNA הוא מפורט.
Noroviruses (NoVs) הם הגורם העיקרי להתפרצויות של גסטרואנטריטיס חריפה ספורדי ברחבי העולם אצל בני אדם בכל הגילאים. הם גורם חשוב אשפוזים בילדים עם השפעה על בריאות הציבור דומה לזה של Rotavirus. NoVs הם וירוסים RNA של המגוון הגנטי גדולה ויש הופעה רצופה של זנים חדשים. חמש genogroups מוכרים: GI ו GII עם גנוטיפים רבים שלהם תת להיות החשובה ביותר עבור הדבקת בני אדם. עם זאת, האבחנה של שני גנוטיפים נותר בעייתי, עיכוב אבחון וטיפול. 1, 2, 3
להפקת RNA מ דגימות צואה השיטה הנפוצה ביותר היא ערכת QIAmp נגיפי RNA מסחרי Qiagen. שיטה זו משלבת את תכונות הקישור של קרום ג'ל סיליקה, מאגרים השולטים RNases ולספק מחייב אופטימלית של רנ"א את לעמודה יחד עם מהירות של microspin. שיטה זו היא פשוטה, מהירה ואמינה והיא קאר IED מתוך מספר צעדים אשר מפורטים תיאור שמספק היצרן.
Norovirus שנייה רק rotavirus כגורם השכיח ביותר של שלשול. אבחון norovirus צריך להיות זמין כל המחקרים על הפתוגנזה של שלשולים כמו גם התפרצויות או במקרים של שלשול בודדים. כיום לעומת זאת האבחנה norovirus מוגבל רק מרכזים מעטים בשל העדר שיטות פשוטות של האבחנה. זה מעכב את האבחון והטיפול 1, 2, 3. בנוסף, בשל עלויות ההובלה מוסדר של מאגרים מאכל בתוך ובין מדינות להשתמש אלה ערכות מתוצרת מציב בעיות לוגיסטיות. כתוצאה מכך, בפרוטוקול זה נתאר אלטרנטיבה, כלכליים, in-house שיטה המבוססת על בום המקורי et al. שיטה 4 אשר משתמשת במאפייני חומצות גרעין מחייב של חלקיקי סיליקה יחד עם תכונות האנטי nuclease של thiocyanate guanidinium .
<p class="Jove_content"> לאיתור genogrouping (GI ו GII) של מבודד NoVs של דגימות צואה, מספר RT-PCR פרוטוקולים ניצול מטרות שונות פותחו. הקונצנזוס הוא כי RT-PCR באמצעות TaqMan הכימיה תהיה הטכניקה הטובה ביותר לאבחון מולקולרי, משום שהוא משלב רגישות וספציפיות גבוהה, שחזור עם קצב העברת נתונים גבוה וקלות השימוש. כאן אנו מתארים assay מיקוד קריאה פתוחה מסגרת 1 (ORF1)-ORF2 באזור צומת; האזור משומר רוב הגנום לנובמבר ולכן המתאים ביותר לאבחון. עבור ניתוח גנטי נוסף קונבנציונלי RT-PCR, כי מטרות משתנה מאוד N-מסוף פגז מן החלבון העיקרי של capsid (אזור C), תוך שימוש primers המתוארים במקור על ידי Kojima et al. 5 הוא מפורט. רצף של מוצר ה-PCR מ-PCR קונבנציונאלי מאפשרת בידול של גנוטיפים השייכים GI ו genogroups GII.שימוש כלכלי in-house שיטה לבידוד חומצות גרעין מ דגימות צואה, נקבל תוצאות שוות כמו המסחרי נגיפי RNA QIAmp ערכת מ Qiagen, ויחד עם TaqMan RT-PCR פותחה במעבדה שלנו אנחנו יכולים לזהות מגוון רחב של נובמבר גנוטיפים השייכים GI ו GII genogroup. פרסום האחרונות של C באזור פרוטוקול דיווחו על שיעורים genotypin…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות Calicivirus המעבדה הלאומית המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) מתנה סוג של כמה תוצאות חיוביות סטנדרטיים ובקרה עבור נובמבר, מעבדות בית הספר לבריאות הציבור באוניברסיטת ג'ונס הופקינס למתן ריאגנטים.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |