Påvisning og Genogrouping av noroviruses fra Barnas Avføring Av Taqman Ett-trinns RT-PCR

Summary

En One-Step RT-PCR-test for påvisning og genogroup identifikasjon av norovirus isolater fra barns avføring, som benytter primere og TaqMan sonder som er spesifikke for den åpne lesing ramme 1 (ORF1)-ORF2 veikryss regionen, den mest bevarte delen av Norovirus genom er beskrevet. En ikke-kommersiell, kostnadseffektiv RNA ekstraksjon metode er beskrevet.

Abstract

Noroviruses (NoVs) er den ledende årsak til utbrudd av sporadisk akutt gastroenteritt i verden i mennesker i alle aldre. De er viktig årsak til sykehusinnleggelser hos barn med en innvirkning på folkehelsen lik som Rotavirus. NoVs er RNA virus av stor genetisk mangfold, og det er en kontinuerlig dukker opp nye stammer. Fem genogroups er anerkjent, GI og GII med sine mange genotyper og subtyper er de viktigste for human smitte. Men fortsatt er diagnosen av disse to genotypene problematisk, forsinke diagnose og behandling. ^{1, 2, 3}

For RNA ekstraksjon fra avføring prøver den mest brukte metoden er QIAmp Viral RNA kommersielle kit fra Qiagen. Denne metoden kombinerer bindende egenskapene til en silikagel membran, buffere som kontroll RNases og gir optimal binding av RNA til kolonnen sammen med hastigheten på microspin. Denne metoden er enkel, rask og pålitelig, og er Carrstudert ute i noen få trinn som er beskrevet i beskrivelsen gitt av produsenten.

Norovirus er andre bare til rotavirus som den vanligste årsaken til diaré. Norovirus diagnose bør være tilgjengelig i alle studier på patogenesen av diaré samt i utbrudd eller individuelle diarétilfeller. I dag derimot norovirus diagnose er begrenset til bare noen få sentre på grunn av mangel på enkle metoder for diagnose. Dette forsinkelser diagnose og behandling ^{1, 2, 3.} I tillegg, på grunn av kostnader og regulert transport av korrosive buffere innen og mellom land bruker av disse produserte pakkene utgjør logistiske problemer. Som et resultat, i denne protokollen beskriver vi en alternativ, økonomisk, in-house metode som er basert på den originale Boom et al. Metode ⁴ som bruker nukleinsyre bindende egenskaper av silika partikler sammen med anti-nuclease egenskaper guanidinium thiocyanate .

<p class="Jove_content"> For deteksjon og genogrouping (GI og GII) av NoVs isolater fra avføring prøver, flere RT-PCR-protokoller som benytter ulike mål er blitt utviklet. Det er enighet om at en RT-PCR ved hjelp TaqMan kjemi ville være det beste molekylær teknikk for diagnose, fordi det kombinerer høy sensitivitet, spesifisitet og reproduserbarhet med høy gjennomstrømning og brukervennlighet. Her beskriver vi en analyse rettet mot åpen leseramme 1 (ORF1)-ORF2 krysset regionen, den mest bevarte delen av NOV genomet og dermed mest egnet for diagnose. For ytterligere genetisk analyse en konvensjonell RT-PCR som er rettet mot den svært variabel N-terminal-shell fra de store protein av kapsid (Region C) ved hjelp av primere opprinnelig beskrevet av Kojima et al. ⁵ er detaljert. Sekvensering av PCR produktet fra konvensjonell PCR muliggjør differensiering av genotyper som tilhører GI og Gii genogroups.

Protocol

1. Avføringsprøver Avføringsprøver bør oppbevares fryst å bevare RNA. For å gjøre en 10% fecal suspensjon, ta ca 0,1 g tint avføringsprøve og fullføre til 1 ml med PBS. Delmengde i 200 mL å unngå gjentatt frysing og tining. Oppbevar alikvoter ved -70 ° C. Tine og sentrifuger alikvoter på 4000 g i 10 min før bruk i utvinning. 2. Utarbeidelse av silika partikler for ekstraksjon med Guanidine & Silica Ved RT, suspendere 30 g av…

Discussion

Bruke økonomiske in-house metode for å isolere nukleinsyre fra avføringsprøver, får vi like resultater som med den kommersielle QIAmp Viral RNA kit fra Qiagen, og sammen med TaqMan RT-PCR utviklet i vårt laboratorium kan vi oppdage et bredt spekter av nov genotyper som tilhører GI og GII genogroup. En fersk publikasjon av regionen C-protokollen rapportert genotyping priser på 78% ^6. Siden mangfoldet av samtidens nov stammer har vært økende i løpet av foregående år, vil suksessraten avhenge av ikk…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100