Detección y Genogrouping de norovirus en las heces de los niños por TaqMan en un solo paso RT-PCR

Summary

Un One-Step RT-PCR para la detección e identificación genogrupo de los aislamientos de Norovirus en las heces de los niños, que utiliza cebadores y sondas TaqMan específicas para el marco de lectura abierto 1 (ORF1)-ORF2 región de la unión, la región más conservada del genoma del norovirus es descrito. Un no-comercial, rentable método de extracción de ARN se detalla.

Abstract

Los norovirus (NOV) son la principal causa de brotes de gastroenteritis aguda esporádica en todo el mundo en los seres humanos de todas las edades. Ellos son causa importante de hospitalización en niños con un impacto en la salud pública similar a la del rotavirus. NOV son virus de ARN de una gran diversidad genética y hay una continua aparición de nuevas cepas. Cinco genogrupos son reconocidos; GI y GII, con sus muchos genotipos y subtipos, siendo los más importantes para la infección humana. Sin embargo, el diagnóstico de estas dos genotipos sigue siendo problemática, retrasando el diagnóstico y tratamiento. ^{1, 2, 3}

Para la extracción de RNA de muestras de heces, el método más comúnmente utilizado es el kit de QIAmp ARN viral comercial de Qiagen. Este método combina las propiedades de unión de una membrana de gel de sílice, tampones que RNasas de control y proporcionan unión óptimos de los ARN a la columna junto con la velocidad de MicroSpin. Este método es sencillo, rápido y fiable y es carrIED en unos pocos pasos que se detallan en la descripción proporcionada por el fabricante.

El Norovirus es sólo superada por rotavirus es la causa más común de diarrea. Diagnóstico de norovirus deben estar disponibles en todos los estudios sobre la patogenia de la diarrea, así como en los brotes de diarrea o de casos individuales. En la actualidad, sin embargo, el diagnóstico de norovirus se limita a unos pocos centros, debido a la falta de métodos sencillos de diagnóstico. Este retraso diagnóstico y el tratamiento ^{1, 2, 3.} Además, debido a los costos de transporte y regulación de los buffers corrosivos dentro y entre los países el uso de estos equipos fabricados plantea problemas logísticos. Como resultado, en este protocolo se describe una alternativa, económica, en casa método que se basa en el original de la pluma y col. Método ^4, que utiliza las propiedades de unión de ácidos nucleicos de partículas de sílice junto con las propiedades anti-nucleasa de tiocianato de guanidinio .

<p class="Jove_content"> Para la detección y genogrouping (GI y GII) de los aislados de muestras de heces NOV, varios protocolos de RT-PCR utilizando los objetivos se han desarrollado diferentes. El consenso es que una RT-PCR utilizando TaqMan química sería la mejor técnica molecular para el diagnóstico, ya que combina una alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad con un alto rendimiento y facilidad de uso. Aquí se describe un ensayo de orientación del marco de lectura abierto 1 (ORF1)-ORF2 región de unión; la región más conservada del genoma NoV y por lo tanto más adecuado para el diagnóstico. Para su posterior análisis genético una RT-PCR convencional que se dirige a la muy variable N-terminal de concha de la principal proteína de la cápside (región C) utilizando cebadores descritas originalmente por Kojima et al. ⁵ se detalla. La secuenciación del producto de PCR de la PCR convencional permite la diferenciación de genotipos pertenecientes al GI y GII genogrupos.

Protocol

1. Las muestras de heces Las muestras de heces deben conservarse congelados para preservar el ARN. Para hacer una suspensión al 10% fecal, tome aproximadamente 0,1 g de muestra de heces descongelado y completar a 1 ml con PBS. Dividir en partes alícuotas en 200 l para evitar los ciclos de congelación y descongelación. Almacene las alícuotas a -70 ° C. Descongele y centrifugue alícuotas a 4.000 g durante 10 minutos antes de su uso en la extracción. 2…

Discussion

Uso de la económica en casa-método para aislar ácido nucleico a partir de muestras de heces, se obtiene resultados iguales como con el kit comercial QIAmp viral de RNA de Qiagen, y junto con la TaqMan RT-PCR desarrollado en nuestro laboratorio que puede detectar una amplia gama de NoV genotipos pertenecientes al GI y GII genogrupo. Una publicación reciente del protocolo de la región C informaron las tasas de genotipado de 78% ^6. Desde la diversidad de las cepas contemporáneas NoV ha ido en aumento duran…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100