Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR
Summary
Astar ve açık okuma çerçevesi 1 (ORF1)-ORF2 kavşak bölgesidir Norovirüs genomunun en korunmuş bölgeye özgü TaqMan probları kullanan çocuk tabureleri, gelen algılama ve Norovirüs izolatların genogroup belirlenmesi için Tek Adım RT-PCR nitelendirdi. Bir ticari olmayan, maliyet-etkin RNA ekstraksiyon yöntemi ayrıntılı olarak verilmiştir.
Abstract
Noroviruses (NoVs) her yaştaki insanlarda dünya çapında sporadik akut gastroenterit salgınlarının önde gelen nedenidir. Onlar Rotavirüs benzer bir halk sağlığı etkisi olan çocuklarda hastaneye yatış önemli nedenlerindendir. NoVs büyük genetik çeşitlilik RNA virüsleri vardır ve yeni suşlar sürekli bir görünümü vardır. Beş genogroups tanınır; GI ve GII onların birçok genotip ve insan enfeksiyonu için en önemli olan alt tipleri ile. Bununla birlikte, bu iki genotiplerinin tan teşhis ve tedavi geciktirilmesi, bir problem teşkil etmektedir. 1, 2, 3
Dışkı örneklerinden RNA ekstraksiyonu için en sık kullanılan yöntem Qiagen gelen QIAmp viral RNA ticari kiti. Bu yöntem, tamponlar, bir silika jel membran bağlanma özelliklerini birleştiren bir kontrol RNases ve microspin hızı ile birlikte kolonuna RNA bağlama optimum sağlar. Bu yöntem basit, hızlı ve güvenilir ve Carr iseüretici tarafından sağlanan açıklama ayrıntılı olarak bir kaç adımda ied.
Norovirüs ishalin en sık nedeni olarak rotavirüs sadece ikinci. Norovirüs tanı ishal patogenezinde tüm çalışmaların yanı sıra salgınlar ya da bireysel ishal vakası mevcut olmalıdır. Şu anda ancak norovirüs tanı tanı basit bir yöntem olmaması nedeniyle sadece birkaç merkezde sınırlıdır. Bu gecikme teşhis ve tedavi 1, 2, 3. Buna ek olarak, ülke içinde ve arasındaki maliyet ve korozif tamponların düzenlenmiş ulaşım nedeniyle lojistik problemler ortaya çıkarır, bu mamul kitleri kullanın. Sonuç olarak, bu protokolde, orijinal Bom dayalı bir alternatif, ekonomik, in-house yöntemi tarif ark guadinyum tiyosiyanat ile anti-nükleaz özellikleri ile birlikte silika partiküllerinin nükleik asit bağlama özellikleri kullanır. Yöntemi 4 .
<p class=Dışkı örnekleri, farklı hedefler kullanıldığı birkaç RT-PCR protokollerden NoVs izolatlarının tespiti ve genogrouping (GI ve GII) için "jove_content"> geliştirilmiştir. Uzlaşma yüksek duyarlılık, özgüllük ve yüksek verimlilik ve kullanım kolaylığı ile tekrarlanabilirliği birleştirir çünkü TaqMan kimya kullanarak bir RT-PCR, tanı için en iyi moleküler teknik olacağını olmasıdır. Burada, açık okuma çerçevesinin 1 (ORF1)-ORF2 bileşke bölgeye yönelik bir deneyde tarif; teşhisi için böylece en korunmuş Ara genomunun bölgesi ve en çok uygundur. Daha da gen analizinde kapsid (Bölge C) aslen Kojima ve arkadaşları tarafından tarif primerler kullanılarak. 5 büyük protein son derece değişken N-terminal-kabuk hedef geleneksel bir RT-PCR için ayrıntılı olarak verilmiştir. Konvansiyonel PCR ile PCR ürün Sekanslayan GI ve GII genogroups ait genotiplerinin farklılaşma sağlar.Protocol
Discussion
Dışkı örneklerinden nükleik asit izolasyonu için yöntem içi ekonomik kullanarak, Qiagen gelen ticari QIAmp viral RNA kiti ile eşit sonuçlar elde ve birlikte TaqMan RT-PCR Laboratuvarımızda geliştirilen ile biz Kas geniş bir algılayabilir GI ve GII genogroup ait genotipler. Bölgenin C protokolünün yeni bir yayın% 78 6 genotipleme oranları bildirdi. Çağdaş Kas suşların çeşitliliğin önceki yıllarda artan bu yana, başarı oranı test edilen numuneler için bölgede C primerlerin uyu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Kas için bir standart ve kontrol pozitiflerin tür hediye için Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) teşekkür ve reaktiflerin sağlanması için Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu Laboratuvarları olacaktır.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
