מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital
Summary
אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.
Abstract
מחזורי גיוס של לויקוציטים מזרם הדם אל הרקמה הדלקתית היא תהליך חיוני ומורכב של 1,2 דלקת. ב venules postcapillary של רקמה דלקתית, leukocytes בתחילה לקשור אנד רול על פני השטח של הקיר luminal venular. רולינג מעצר leukocytes על האנדותל ולעבור הידבקות המשרד בתגובה chemokine או chemoattractants אחרים על פני venular. Leukocytes חסיד רבים לעבור מאתר הראשונית של הידבקות לאתר extravasation junctional ב האנדותל, תהליך שמכונה intraluminal זחילה 3. לאחר זחילה, leukocytes לנוע על פני האנדותל (גלגול) ולהעביר ברקמות extravascular לעבר מקור chemoattractant (chemotaxis) 4. מיקרוסקופיה Intravital הוא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה ליקוציט-אנדותל האינטראקציות תא in vivo ו חושף מנגנונים תאית ומולקולרית של גיוס לויקוציטים 2,5. בדו"ח זה, אנו מספקים תיאור מקיף של באמצעות מיקרוסקופ brightfield intravital לחזות ולקבוע את תהליכי מפורט של גיוס נויטרופילים בשריר cremaster עכבר בתגובה שיפוע של chemoattractant נויטרופילים. כדי לגרום לגיוס נויטרופילים, פיסה קטנה של ג'ל agarose (~ 1-3 מ"מ גודל) המכיל chemoattractant נויטרופילים MIP-2 (CXCL2, chemokine CXC) או WKYMVm (TRP-Lys-Tyr-Val-D-Met, אנלוגי סינתטי של פפטיד חיידקי) מושם על ברקמת השריר הסמוך ורדיד postcapillary ציין. עם הזמן שחלף צילום וידאו במחשב תוכנה ImageJ, זחילה נויטרופילים intraluminal על האנדותל, הגירה transendothelial נויטרופילים ואת הגירה chemotaxis ברקמות הם דמיינו מסומנים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח אמין כמותי של פרמטרים רבים לגיוס נויטרופילים כגון מהירות זחילה intraluminal, גלגול זמן, זמן הניתוק, מהירות העברה, מהירות chemotaxis ומדד chemotaxis ברקמות. אנו מראים כי בפרוטוקול זה, פרמטרים אלה גיוס נויטרופילים ניתן לקבוע ביציבות לבין תנועה תא בודד מעקב נוח in vivo.
Protocol
Discussion
מיקרוסקופיה Intravital הוא כלי חיוני לחשוף את מנגנוני תאית ומולקולרית של גיוס לויקוציטים במהלך דלקת. ויזואליזציה כמותיים לקביעת ליקוציט-אנדותל האינטראקציות תא microvasculature transluscent של רקמות כמו שריר cremaster ו mesentery נותר תקן הזהב עבור היישום של הטכניקה 1,5. מיקרוסקופיה קונב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר קנדי Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). ל ליו הוא חתן פרס החוקר CIHR חדש (MSH-95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
