Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital
Summary
Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.
Abstract
El reclutamiento de leucocitos circulantes del torrente sanguíneo al tejido inflamado es un proceso crucial y compleja de 1,2 inflamación. En las vénulas postcapilares de tejido inflamado, leucocitos inicialmente cuerda y rodar sobre la superficie luminal de la pared venular. Rolling arresto leucocitos en el endotelio y se someten a la adhesión firme en respuesta a quimioquinas o quimiotácticos otros en la superficie venular. Muchos leucocitos adherentes trasladarse desde el sitio inicial de la adhesión al lugar de la extravasación de la unión en el endotelio, un proceso denominado intraluminal arrastrándose 3. Después de gatear, los leucocitos se mueven a través del endotelio (transmigración) y migran en el tejido extravascular hacia la fuente de quimioatrayente (quimiotaxis) 4. Microscopia intravital es una poderosa herramienta para la visualización de las interacciones leucocito-endotelial de células in vivo y revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos 2,5. En este informe, se presenta una descripción completa de la utilización de la microscopía intravital campo claro para visualizar y determinar los procesos detallados de reclutamiento de neutrófilos en el ratón músculo cremáster en respuesta a la pendiente de un quimioatrayente de neutrófilos. Para inducir el reclutamiento de neutrófilos, un pequeño trozo de gel de agarosa (~ 1 mm de tamaño 3) con recuento de neutrófilos chemoattractant MIP-2 (CXCL2, una quimiocina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un análogo sintético del péptido bacteriano) se coloca en el tejido muscular adyacente a la vénula postcapilares observado. Con el tiempo transcurrido fotografía de vídeo y el ordenador el software ImageJ, el rastreo de neutrófilos intraluminal en el endotelio, la migración de neutrófilos y transendotelial la migración y la quimiotaxis de los tejidos se visualizan y seguimiento. Este protocolo permite a los análisis cuantitativos y fiables de muchos parámetros de reclutamiento de neutrófilos, tales como la velocidad de rastreo intraluminal, el tiempo de la transmigración, el tiempo de separación, la velocidad de la migración, la velocidad de la quimiotaxis y el índice de quimiotaxis en el tejido. Se demuestra que el uso de este protocolo, estos parámetros el reclutamiento de neutrófilos puede ser estable y determinado la locomoción sola célula convenientemente seguimiento en vivo.
Protocol
Discussion
Microscopia intravital es la herramienta esencial para revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Visualización para la determinación cuantitativa de las interacciones leucocito-endotelial en la microvasculatura de los tejidos translúcidos como el músculo cremáster y mesenterio sigue siendo el estándar de oro para la aplicación de la técnica de 1,5. La microscopía de campo claro intravital convencional tiene muchas características técnicas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, MOP-86749). L. Liu es un recipiente del Premio de CIHR Nueva Investigador (MSH-95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
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