Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Summary

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Abstract

וגינוזיס בקטריאלי (BV) היא תסמונת polymicrobial חוזרת מאופיין בשינוי החיידקים "נורמלי" של לקטובצילוס הנשלטת על החיידקים הנשלט על ידי מספר מינים חיידקי, כולל vaginalis Gardnerella, Atopobium vaginae ועוד ^1-3. מצב זה קשור עם מגוון של תוצאות בריאותיות שליליות, כולל איידס רכישת ^4, וזה יכול להיות קשה לנהל קלינית ^5. יתר על כן, האבחנה של BV הסתמכה על השימוש גראם כתמים של מריחות משטח וגינאלי, כי הם ציונים מספריים על קריטריונים שונים ^6,7. בעוד אבחון זה הוא פשוט, לא יקר, מתאים גם משאב מוגבל הגדרות, זה יכול סובלים מבעיות הקשורות פרשנויות סובייקטיביות זה לא נותן פרופיל מפורט של הרכב החיידקים הנרתיק ^8. מאמצים אחרונים רצף עמוק חשפו החיידקים עשיר, מגוון עם הנרתיקהבדלים ברורים בין דגימות שנלקחו מאנשים אשר מאובחנים עם BV לעומת אותם אנשים שנחשבים ^9,10 נורמלי, אשר הביאה לזיהוי של מספר יעדים פוטנציאליים לאבחון מולקולרי של BV ^11,12. מחקרים אלו סיפקו שפע של מידע שימושי, אבל רצף עמוק עדיין לא מעשית כשיטת אבחון בסביבה קלינית. תיארנו לאחרונה שיטה מהירה לאפיון החיידקים בנרתיק במתכונת זמנית באמצעות oligonucleotide מצמידים חרוזי ניאון עם זיהוי על פלטפורמה Luminex ^13. שיטה זו, כמו כתם הנוכחי מבוסס שיטות סבתא, היא מהירה ופשוטה אבל מוסיפה את יתרון נוסף של ניצול הידע המולקולרי הנובעים רצף לימודי עיצוב בדיקה. שיטה זו ולכן מספק דרך הפרופיל מיקרואורגניזמים העיקריים נמצאים מקלון הנרתיק שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן BV עם סגוליות גבוהה comp רגישותared כדי גראם כתם תוך מתן מידע נוסף על נוכחות מינים ושפע באופן חצי כמותי ומהיר. שיטה זו זמנית ניתן להרחבה גם מעבר לטווח של PCR כמותי מבחני הנוכחי של אורגניזמים מסוימים, אשר כרגע מוגבל ל 5 או 6 מבחני שונים יחיד מדגם ^14. חשוב לציין כי השיטה אינה מוגבלת לזיהוי דגימות של חיידקים בנרתיק ניתן להתאים בקלות במהירות פרופיל כמעט כל הקהילה מיקרוביאלי של עניין. לדוגמה, יש לנו לאחרונה החל ליישם מתודולוגיה לפיתוח של כלי אבחון לשימוש בצמחים וטיפול בשפכים.

Protocol

שיטה זו שימשה במחקר דיווחו Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). תרשים סכמטי המתאר את הליך הכולל מוצג באיור 1. 1. ביד צימוד זה מתאר את שיטות ל…

Discussion

סגוליות של הדור אות היא בעלת חשיבות מכרעת, אתה חייב להיות בטוח כי האות שנצפה באמת משקף את הזיהוי של amplicon שנוצר אורגניזם הזה. תוכנות כגון PrimerPlex (פרמייר Biosoft) יכול לעזור לתכנן בדיקות אשר להכליא ביעילות, אבל הם עשויה או לא עשויה לחצות להכליא ליעד הלא מינים. כאשר אוניברסלי p…

Materials

Oligonucleotide name	Company	Sequence1
H279BP	Invitrogen, IDT, or other	Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G.

Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC)	Pierce	22980
Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad)	Luminex or Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier	Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors.
Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified)	Invitrogen, IDT, or other	various	Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13.
T7 exonuclease	New England Biolabs	M0263S
Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended
Thermowell 96 well PCR plates	Fisher	CS006509	fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine
Thermowell sealing mat	Fisher	CS006555	Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry
5M TMAC	Sigma	T3411
Bio-Plex or Luminex instrument	Bio-Rad or Luminex	Bio-Rad : 171-000201
PrimerPlex software for probe design	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used

Table 2. Specific reagents and equipment.

component	μl/assay	μl/100 assays	final concentration
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl2 (Invitrogen)	2.5	250	2.5 mM
10 mM dNTP	1	100	0.2 mM each
H279BP, 25 μM	0.25	25	375 nM
H1612BP, 25 μM	0.75	75	125 nM
H280, 25 μM	0.25	25	375 nM
H1613, 25 μM	0.75	75	125 nM
Water	34	3400	—
Totals	44.5	4450

Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.