Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes
Summary
Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.
Abstract
Vaginose bacteriana (BV) é uma síndrome recorrente polimicrobiana que se caracteriza por uma mudança na microbiota "normal" de Lactobacillus dominado a uma microbiota dominado por um número de espécies de bactérias, incluindo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e outros 1-3. Esta condição está associada com uma série de resultados negativos de saúde, incluindo HIV aquisição 4, e pode ser difícil de gerir clinicamente 5. Além disso, o diagnóstico de BV tem contado com o uso de manchas Gram de esfregaço de swab vaginal que são pontuados em vários critérios numéricos 6,7. Embora este diagnóstico é simples, barato e bem adequado para ambientes de recursos limitados, que podem sofrer de problemas relacionados com interpretações subjetivas e não dar um perfil detalhado da composição da microbiota vaginal 8. Recentes esforços de seqüenciamento de profundidade revelaram uma rica, diversificada microbiota vaginal comdiferenças claras entre as amostras retiradas de indivíduos que são diagnosticados com BV em comparação com aqueles indivíduos que são considerados normais 9,10, o que resultou na identificação de um número de alvos potenciais para o diagnóstico molecular da BV 11,12. Esses estudos têm fornecido uma riqueza de informação útil, mas seqüenciamento profunda ainda não é prática como um método de diagnóstico em um ambiente clínico. Recentemente, descreveu um método para rapidamente perfil da microbiota vaginal em um formato multiplex usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes com detecção em uma plataforma Luminex 13. Este método, como o atual Gram métodos baseados, é rápido e simples, mas acrescenta a vantagem adicional de explorar os conhecimentos moleculares decorrentes de estudos de seqüenciamento no projeto da sonda. Este método, portanto, fornece uma maneira de perfil dos microorganismos mais importantes que estão presentes em um swab vaginal que podem ser usadas para diagnosticar BV, com alta especificidade e sensibilidade compared para Gram, fornecendo informações adicionais sobre a presença e abundância de espécies de uma forma semi-quantitativa e rápida. Este método multiplex é expansível bem além do alcance dos atuais ensaios de PCR quantitativo para os organismos particular, que é actualmente limitado a 5 ou 6 ensaios diferentes em uma única amostra 14. Importante, o método não se limita à detecção de bactérias em swabs vaginal e pode ser facilmente adaptado para rapidamente perfil quase qualquer comunidade microbiana de interesse. Por exemplo, temos recentemente começaram a aplicar esta metodologia para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico para uso em estações de tratamento de águas residuais.
Protocol
Discussion
A especificidade da geração do sinal é de fundamental importância, você deve estar confiante de que o sinal observado reflecte verdadeiramente a detecção de amplicon gerado a partir desse organismo. Software, tais como PrimerPlex (Premier Biosoft) pode ajudar a projetar as sondas que hibridizam de forma eficiente, mas eles podem ou não podem cruzar-hibridizar espécies não-alvo. Quando primers universais PCR são utilizados, como descrito neste protocolo, é importante ter em mente que o amplicon gerado represe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Alberto Severini e Vanessa Goleski para ajudar no desenvolvimento de ensaios e comentários críticos sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Agência Canadense de Saúde Pública e do Programa de Assistência de Pesquisa Industrial (National Research Council of Canada). Apoio adicional foi obtida a partir da Universidade de Saskatchewan Fundo de Publicação.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
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