Multiplex Påvisning av bakterier i Complex Clinical and Environmental Prøver å bruke oligonukleotid-coupled Fluorescent Mikrokuler
Summary
Vi beskriver en multiplex metode for påvisning av mikroorganismer i en prøve med oligonukleotid-kombinert fluoriserende perler. Amplicon fra alle organismer innen en prøve er hybridisert til et panel av probe-koblet perler. En Luminex eller Bio-Plex instrumentet brukes til å spørre hver perle for perle type og hybridisering signal.
Abstract
Bakteriell vaginose (BV) er et tilbakevendende polymikrobielle syndrom som er karakterisert ved en endring i "normal" microbiota fra Lactobacillus-dominert til et microbiota dominert av en rekke av bakterielle arter, inkludert Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae og andre 1-3. Denne tilstanden er forbundet med en rekke negative helseutfall, deriblant HIV anskaffelse 4, og det kan være vanskelig å håndtere klinisk 5. Videre har diagnosen BV stolt på bruk av Gram flekker av vaginal vattpinne utstryk som er scoret på ulike numeriske kriterier 6,7. Selv om dette diagnostiske er enkel, billig og godt egnet til ressurs-begrensede innstillinger, kan det lider av problemer knyttet til subjektive tolkninger og det gir ikke en detaljert profil av sammensetningen av vaginal microbiota 8. Nyere dype sekvensering innsats har avdekket en rik og mangfoldig vaginal microbiota medklare forskjeller mellom prøver tatt fra personer som er diagnostisert med BV i forhold til de individer som anses normal 9,10, noe som har resultert i identifisering av en rekke potensielle mål for molekylær diagnostikk av BV 11,12. Disse studiene har gitt et vell av nyttig informasjon, men dypt sekvensering er ennå ikke praktisk som en diagnostisk metode i en klinisk setting. Vi har nylig beskrevet en metode for raskt profilering vaginal microbiota i en multiplex format ved hjelp oligonukleotid-coupled fluoriserende perler med deteksjon på en Luminex plattform 13. Denne metoden, som nåværende Gram stain-baserte metoder, er rask og enkel, men legger den ekstra fordelen av å utnytte molekylær kunnskap oppstår fra sekvensering studier i probe design. Denne metoden gir derfor en måte å profilere viktige mikroorganismer som er tilstede i en vaginal vattpinne som kan brukes til å diagnostisere BV med høy spesifisitet og sensitivitet compared til Gram stain samtidig som det gir ytterligere informasjon om artene tilstedeværelse og overflod i en semi-kvantitativ og rask måte. Denne multiplex metoden kan utvides godt utover rekkevidden til dagens kvantitative PCR-analyser for aktuelle organismer, som er foreløpig begrenset til 5 eller 6 forskjellige analyser i en enkelt prøve 14. Viktigere, er metoden ikke begrenset til påvisning av bakterier i skjeden vattpinner og kan enkelt tilpasses raskt profilen nesten alle mikrobielle samfunn av interesse. For eksempel har vi nylig begynt å bruke denne metodikken til utvikling av diagnostiske verktøy for bruk i avløpsrenseanlegg.
Protocol
Discussion
Spesifisiteten av signal generasjon er av avgjørende betydning, og du må være trygg på at signalet observert virkelig reflekterer påvisning av amplicon generert fra den organisme. Programvare som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan bidra til å utforme sonder som skal hybridize effektivt, men de kan eller ikke kan kryss-hybridize til non-target arter. Når universell PCR primere brukes som beskrevet i denne protokollen, er det viktig å huske på at amplicon genererte representerer alle organismer til stede i prøven….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Alberto Severini og Vanessa Goleski for hjelp med analysen utvikling og kritiske kommentarer til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Public Health Agency of Canada og Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ekstra støtte ble hentet fra University of Saskatchewan Publication fondet.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
