Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI
Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-Visualisierung<em> C. elegans</em> Mit dem rot fluoreszierenden Farbstoff lipophil DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat), die häufig in Verwendung<em> C. elegans</em> Zu visualisieren umwelt ausgesetzt Neuronen. Mit diesem optimierten Protokoll werden Alen und ringförmige Strukturen Kutikula von DiI gefärbt und mit der Verbindung der Mikroskopie.
Abstract
Die Kutikula von C. elegans ist eine sehr widerstandsfähige Struktur, die das Äußere des Tieres 1-4 umgibt. Die Nagelhaut schützt nicht nur das Tier aus der Umwelt, sondern bestimmt auch Körperform und spielt eine Rolle in Motilität 4-6. Mehrere Schichten von epidermalen Zellen abgesondert umfassen die Kutikula, darunter eine äußerste Lipid-Schicht 7.
Umlaufende Stege in der Kutikula genannt Kreisringe Muster der Länge des Tieres und sind in allen Phasen der Entwicklung 8 vorhanden. Alae sind Längsrippen, die vorhanden sind während bestimmter Phasen der Entwicklung, darunter L1, Dauer, und adulte Stadien 2,9. Mutationen in Genen, die Kutikula Kollagen Organisation beeinflussen können alter Kutikula Struktur und tierischen Körper Morphologie 5,6,10,11. Während Kutikula Bildgebung mit Verbindung Mikroskopie mit DIC-Optik ist es möglich, aktuelle Methoden, die Highlight Kutikula Strukturen gehören FluoreszenzProzent Transgenexpression 12, Antikörper-Färbung 13 und Elektronenmikroskopie 1. Labeled Weizenkeimagglutinin (WGA) wurde ebenfalls verwendet, um Kutikula Glykoproteine visualisieren, ist aber bei der Lösung von feineren Strukturen Kutikula 14 begrenzt. Die Färbung der Kutikula Oberfläche unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff wurde beobachtet, aber nie im Detail 15 gekennzeichnet. Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-C visualisieren elegans mit dem rot fluoreszierenden Farbstoff lipophil DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat), die üblicherweise in C verwendet elegans zu visualisieren umwelt ausgesetzt Neuronen. Diese optimierte Protokoll für DiI Färbung ist eine einfache, robuste Methode für hochauflösende Fluoreszenz-Visualisierung von Ringen, alae, Vulva, männlichen Schwanz, und Hermaphroditen Tailspike in C. elegans.
Protocol
Discussion
Die DiI Färbung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, um die Schuppenschicht in C. elegans zu visualisieren. Durch Wiederverwendung und Optimierung eines Verfahrens gemeinhin Bild umwelt ausgesetzt sensorischen Neuronen 15,17 verwendet wird, kann DiI verwendet werden, um Fluoreszenz-Färbung sowohl Alen und ringförmige Strukturen (Abbildungen 1 und 2) sowie der Vulva, männlichen Schwanz, und Hermaphroditen Tailspike werden (Abbildung 3). Wir haben fe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske und HC danken. Hsiao für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem TAMHSC Department of Molecular and Cellular Medicine finanziert. Die Verbindung Umfang und drehende Scheibe wurden mit Mitteln der Abteilung und des TAMHSC Dekanat vorgesehen erworben. Einige Stämme wurden von den Caenorhabditis Genetics Center, das vom National Center for Research Resources finanziert wird. pRF4 (rol-6 (su1006)) war ein Geschenk von A. Fire.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
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