La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII
Summary
Se presenta un método para visualizar la cutícula en vivo<em> C. elegans</em> Con el fluorescente de color rojo lipofílico DII colorante (1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que se utiliza comúnmente en<em> C. elegans</em> Para visualizar las neuronas el medio ambiente expuestos. Con este protocolo optimizado, las estructuras de alas y de anular la cutícula están manchadas por el DII y observó mediante microscopía de compuesto.
Abstract
La cutícula de la C. elegans es una estructura muy resistente que rodea el exterior del animal 1-4. La cutícula no sólo protege al animal del medio ambiente, sino que también determina la forma del cuerpo y juega un papel en la motilidad 4-6. Varias capas secretada por las células epidérmicas forman la cutícula, que incluye una capa lipídica externa 7.
Crestas circunferenciales en la cutícula del llamado patrón de anillos de la longitud del animal, y están presentes en todas las etapas de desarrollo 8. Las alas son crestas longitudinales que están presentes durante las etapas específicas del desarrollo, incluyendo L1, Dauer, y adulto 2,9. Las mutaciones en los genes que afectan a la organización del colágeno cuticular puede alterar la estructura de la cutícula y la morfología corporal del animal 5,6,10,11. Mientras que imágenes cuticular mediante microscopía óptica compuesto con DIC es posible, métodos actuales que ponen de relieve las estructuras cuticulares son fluorescentesciento de expresión del transgen 12, la tinción de anticuerpos 13, y la microscopía electrónica 1. Etiquetados aglutinina de germen de trigo (WGA) también se ha utilizado para visualizar las glicoproteínas cuticular, pero está limitado en la resolución de las estructuras más finas cuticular 14. Tinción de la superficie de la cutícula con un tinte fluorescente se ha observado, pero nunca caracterizado en detalle 15. Se presenta un método para visualizar la cutícula en vivo C. elegans con el fluorescente de color rojo lipofílico DII colorante (1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que se utiliza comúnmente en C. elegans para visualizar las neuronas el medio ambiente expuestos. Este protocolo optimizado para la tinción de Dii es un método simple y robusto para la visualización de alta resolución de anillos fluorescentes, las alas, la vulva, la cola masculina, y hermafroditas cola aumento en C. elegans.
Protocol
Discussion
El método de tinción DII que aquí se presenta permite una manera relativamente rápida y conveniente de visualizar la cutícula en C. elegans. Por reutilización y optimización de un método comúnmente utilizado para la imagen del medio ambiente expuestos neuronas sensoriales 15,17, DII puede ser utilizado para teñir con fluorescencia tanto alas y estructuras anulares (Figuras 1 y 2), así como la vulva, la cola masculina, y hermafroditas cola pico (Figura 3). Hemos encontrado que la solución …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a S. Taneja-Bageshwar, Beifuss K., S. Kedroske y HC. Hsiao útil para los debates. Este trabajo fue financiado por la puesta en marcha de los fondos del Departamento TAMHSC de Medicina Molecular y Celular. El alcance compuesto y disco giratorio fueron comprados con fondos aportados por el departamento y la Oficina TAMHSC del Decano. Algunas cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por el Centro Nacional para Recursos de Investigación. pRF4 (rol-6 (su1006)) fue un regalo de fuego A..
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
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