Visualisering av Caenorhabditis elegans Cuticle Structures Bruke Lipofile Vital Dye, DII
Summary
Vi presenterer en metode for å visualisere cuticle i live<em> C. elegans</em> Med røde fluorescerende lipofile fargestoff DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat), som ofte brukes i<em> C. elegans</em> For å visualisere miljømessig utsatt nerveceller. Med denne optimalisert protokollen, alae og ringformet cuticular strukturer farget av DII og observert bruk sammensatte mikroskopi.
Abstract
Cuticle av C. elegans er en svært motstandsdyktig struktur som omgir utsiden av dyret 1-4. Cuticle ikke bare beskytter dyret fra omgivelsene, men også bestemmer kroppsform og spiller en rolle i motilitet 4-6. Flere lag utskilt av epidermale celler omfatter skjellaget, inkludert en ytterst lipid lag 7.
Omkrets rygger i skjellaget kalt annuli mønster lengden på dyret, og er til stede under alle utviklingsstadier 8. Alae er langsgående rygger som er til stede under spesifikke utviklingsstadier, inkludert L1, dauer, og voksne stadier 2,9. Mutasjoner i gener som påvirker cuticular kollagen organisasjon kan endre cuticular struktur og dyr kroppsplanen 5,6,10,11. Mens cuticular bildebehandling bruker sammensatte mikroskopi med DIC optikk er mulig, dagens metoder som synliggjør cuticular strukturer inkluderer fluoressent transgenet uttrykk 12, antistoff flekker 13, og elektron en mikroskopi. Merket hvetespirer agglutinin (WGA) har også blitt brukt til å visualisere cuticular glykoproteiner, men er begrenset i løse finere cuticular strukturer 14. Farging av cuticular overflaten ved hjelp av fluoriserende fargestoff har blitt observert, men aldri karakterisert i detalj 15. Vi presenterer en metode for å visualisere cuticle i live C. elegans med røde fluorescerende lipofile fargestoff DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat), som ofte brukes i C. elegans å visualisere miljømessig utsatt nerveceller. Dette optimalisert protokoll for DII farging er en enkel, robust metode for høy oppløsning fluorescerende visualisering av annuli, alae, vulva, male hale, og hermafroditt hale pigg i C. elegans.
Protocol
Discussion
Den DII flekker Metoden som presenteres her gir en relativt rask og praktisk måte å visualisere skjellaget i C. elegans. Ved repurposing og optimalisering av en metode som ofte brukes til å image miljømessig utsatt sensoriske nevroner 15,17, kan DII brukes til fluorescensmerket flekker både alae og ringformede strukturer (Figur 1 og 2), samt vulva, male hale, og hermafroditt hale spike (figur 3). Vi har funnet ut at inkubasjonstiden løsningen og tid påvirke evnen til DII å konsekvent stain cu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, og HC. Hsiao for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av oppstarten midler fra TAMHSC Department of Molecular and Cellular Medicine. Den sammensatte omfang og spinning disk ble kjøpt med midler gitt av avdelingen og TAMHSC kontor Dean. Noen stammer var gitt av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) var en gave A. Fire.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. . C. elegans Atlas. , (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
