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Immunology and Infection

リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して

Published: November 01, 2011
doi:
10.3791/3400
, , ,
1Department of Pathology,University of Texas Medical Branch

Summary

リフトバレー熱ウイルスMP – 12ワクチン株の逆遺伝学的システムは、追加のMP – 12の増加減衰および免疫原性と変異体を作成するための便利なツールです。我々はNSS変異株を生成し、特徴付けるためにプロトコルについて説明します。

Abstract

出血熱、神経疾患やヒトの失明、そして高レートの中絶と反芻動物1の胎児の奇形を引き起こすリフトバレー熱ウイルス（RVFV）は、選択剤とリスクグループ3の病原体を重ねるHHS / USDAとして分類されている。それは、ブニヤウイルス科の属Phlebovirusに属し、このファミリーの中で最も毒性の強いメンバーの一人です。 RVFV MP – 12ワクチン株2,3だけでなく、ZH548とZH501を含む野生型RVFV株4-6、、のためのいくつかのリバースジェネティクスシステムが2006年から開発されている。 MP – 12株は、（リスクグループ2病原体および非選択剤である）のM -およびL -セグメントでいくつかの変異によって高度に弱毒化ですが、それでも機能的な病原性をコード病原性S -セグメントRNA 3を 、運ぶ要因、NSS。それはとしてeffic複製しながらNSS ORFの欠失、フレームの69％を運ぶrMP12 – C13type（C13type）は、すべての既知のNSSの機能を欠いているIENTは、VeroE6細胞におけるMP – 12は、タイプ- I IFNを欠いていません。 NSSは、インターフェロン（IFN）-βmRNAの7,8を含むホストの転写のシャットオフを誘導し、翻訳後レベルでの二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）の分解を促進する。9,10 IFN -βの転写であるインターフェロン調節因子3（IRF – 3）、NF – kBからアクチベーター蛋白質1（AP – 1）、およびIFN-alpha/beta受容体へのIFN -βの結合（IFNAR）によって上方制御は、IFN -αの転写を刺激するNSSによるIFN -β遺伝子を含むホストの転写抑制はウイルス複製に応答してそれらのISGsの遺伝子のupregulationsを防ぐ一方で、宿主の抗ウイルス活性を誘導する遺伝子または他のインターフェロン刺激遺伝子（ISGs）11、もののIRF – 3、NF – kBから活性化因子タンパク質- 1（AP – 1）RVFV7によって活性化することができます。 。このように、NSSはさらにMP – 12を減衰させる、およびIFN -β抑制機能を廃止することによって宿主自然免疫応答を高めるために優秀なターゲットです。ここ、我々は組換えMP – 12エンコーディング変異NSSを生成するためのプロトコルを記述し、IFN -βmRNAの合成を抑制する機能を欠いているNSS変異体を同定するためのスクリーニング方法の例を提供しています。自然免疫におけるその重要な役割に加えて、I型IFNは、樹状細胞と適応免疫応答12-14誘導の成熟にとって重要です。従って、I型IFNを誘導するNSSの変異体は、さらに減衰されますが、同時にそれらのワクチン接種のアプローチのための理想的な候補になる野生型MP – 12、より宿主の免疫応答を刺激するより効率的です。

Protocol

1。プラスミドDNAから組換えMP – 12エンコーディングのNSSの変異（S）2の回収スプレッドベビーハムスター腎臓（BHK）最小必須培地（MEM）-α（Invitrogen社、カタログ番号32561037）を含む10％ウシ胎児血清（FBS 6 cmのディッシュに安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼ/ T7 – 9細胞15、、 ）、ペニシリン – ストレプトマイシン（ペニシリン：100 U / mlと、ストレプトマイシン：100μg/ …

Discussion

RVFVのために遺伝学のシステムを逆には、T7プロモーター2,4,5またはマウス3またはヒトの4 POL – Iプロモーターを利用していくつかのグループによって開発されている。この原稿では、我々はBHK/T7-9セル15その安定的に発現するT7 RNAポリメラーゼを用いて組換えRVFV MP – 12株を生成するためのプロトコルについて説明します。 BHK/T7-9細胞の状態によって異なるウイル…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、グラントの数5エクセレンスの西部地域センター（WRCE）を通じて、U54 AI057156 – 07、アレルギーや国立感染症研究所から1 R01 AI08764301 – A1、および大学のワクチン開発のためのシーリーセンターの内部資金によって賄われていたテキサスメディカルブランチ。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037  
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092  
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR  
Tryptose phosphate broth MP biomedicals 1682149  
Noble agar VWR 101170-362  
TransIT-LT1 Mirus MIR2300  
Opti-MEM Invitrogen 31985070  
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25  
0.33% neutral red solution Sigma Aldrich N2889-100ML  
C57/WT MEF cells InvivoGen mef-c57wt  
Blasticidin S InvivoGen Ant-bl-1  
Zeocin InvivoGen ant-zn-1  
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1  
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan    
Vero E6 cells ATCC CRL-1586  
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References

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Tags

Reverse GeneticsNSs GeneRift Valley Fever VirusMP-12 StrainVaccine SafetyVaccine EfficacyHemorrhagic FeverNeurological DisordersBlindnessAbortionFetal MalformationHHS/USDA Overlap Select AgentRisk Group 3 PathogenPhlebovirusBunyaviridae FamilyVirulentRVFV MP-12 Vaccine StrainWild-type RVFV StrainsZH548ZH501M-segmentL-segmentS-segment RNA3Functional Virulence Factor NSsRMP12-C13typeIn-frame Deletion Of NSs ORFHost Transcription Shut-offInterferon (IFN)-beta MRNA78Double-stranded RNA-dependent Protein Kinase (PKR)Post-translational Level Degradation Of PKR
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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).
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