Ved hjelp av revers genetikk å manipulere NSS Gene av Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain å forbedre Vaccine sikkerhet og effekt
Summary
Den revers genetikk system for Rift Valley fever virus MP-12 vaksinestammen er et nyttig verktøy for å skape ekstra MP-12 mutanter med økt demping og immunogenisitet. Vi beskriver protokollen til å generere og karakterisere NSS mutant stammer.
Abstract
Rift Valley fever virus (RVFV), som forårsaker hemoragisk feber, nevrologiske lidelser eller blindhet hos mennesker, og en høy abort og fosterets misdannelser hos drøvtyggere 1, har blitt klassifisert som et HHS / USDA overlapping velge agent og en risikogruppe 3 patogen. Den tilhører slekten Phlebovirus i familien Bunyaviridae og er en av de mest virulente medlemmene av denne familien. Flere revers genetikk systemer for RVFV MP-12 vaksinestammen 2,3 samt villtype RVFV stammer 4-6, herunder ZH548 og ZH501, har blitt utviklet siden 2006. MP-12 belastning (som er en risiko gruppe 2 patogen og en ikke-velg agent) er svært svekket av flere mutasjoner i M-og L-segmenter, men likevel bærer virulente S-segment 3 RNA, som koder for et funksjonelt virulens faktor, NSS. Den rMP12-C13type (C13type) bærer 69% i-frame sletting av NSS ORF mangler alle de kjente NSS funksjoner, mens det replikeres som efficient som gjør MP-12 i VeroE6 celler mangler type-I IFN. NSS induserer en avstenging av verten transkripsjon herunder interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 og fremmer nedbrytning av dobbel-strandet RNA-avhengig protein kinase (PKR) på posttranslasjonelle nivå. 9,10 IFN-beta er transcriptionally oppregulert med interferon regulerende faktor 3 (IRF-3), NF-kB og aktivator protein-1 (AP-1), og bindingen av IFN-beta til IFN-alpha/beta reseptor (IFNAR) stimulerer transkripsjon av IFN-alfa gener eller andre interferon stimulert gener (ISGs) 11, som induserer vert antiviral aktiviteter, mens host transkripsjon undertrykkelse inkludert IFN-beta genet ved NSS hindrer genet upregulations av de ISGs svar på virusreplikasjon selv om IRF-3, NF-kB og aktivator protein-1 (AP-1) kan aktiveres ved RVFV7. . Dermed er NSS et utmerket mål for ytterligere å dempe MP-12, og for å styrke host medfødte immunresponser ved å avskaffe IFN-beta undertrykkelse funksjon. HerBeskriver vi en protokoll for å generere et rekombinant MP-12 koding mutert NSS, og gi et eksempel på en screening metode for å identifisere NSS mutanter mangler funksjon for å undertrykke IFN-beta mRNA syntese. I tillegg til sin avgjørende rolle i medfødt immunitet, er type-I IFN viktig for modningen av dendrittiske celler og induksjon av en adaptiv immunrespons 12-14. Dermed NSS mutanter inducing type-I IFN er ytterligere svekket, men samtidig er mer effektiv på å stimulere vert immunresponser enn vill-type MP-12, noe som gjør dem ideelle kandidater for vaksinasjon tilnærminger.
Protocol
Discussion
Revers genetikk systemer for RVFV har blitt utviklet av flere grupper ved å utnytte T7 promoter 2,4,5 eller mus 3 eller human fire pol-I promoter. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for å generere rekombinant RVFV MP-12 stammer ved hjelp BHK/T7-9 celler 15 som stabilt uttrykke T7 RNA polymerase. Effektiviteten av viral utvinning varierte avhengig av tilstanden til BHK/T7-9 celler, mengden av plasmider, antall transfektert celler og så videre. Vi har alltid forst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 gjennom Western Regional Center of Excellence (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, og en intern finansiering fra Sealy Center for Vaccine Development ved Universitetet i Texas Medical Branch.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
