Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l'échelle écrans ARNi dans C. elegans</em

Summary

Nous décrivons un protocole à l'aide<em> C. elegans</em> Et les bibliothèques d'alimentation ARNi qui permet la mesure automatisée de plusieurs paramètres tels que la fluorescence, la taille et l'opacité de chaque ver dans une population. Nous donnons un exemple d'un écran pour identifier les gènes impliqués dans la lutte contre l'immunité innée dans fongique<em> C. elegans</em>.

Abstract

L'ARN interférence est une méthode puissante pour comprendre la fonction des gènes, en particulier quand elles sont menées à une échelle du génome entier et dans un contexte quantitatif. Dans C. elegans, la fonction du gène peut être renversé simplement et efficacement en se nourrissant les vers avec des bactéries exprimant un ARN double brin correspondant à un gène spécifique ^1. Alors que la création de bibliothèques de clones d'ARNi couvrant la plupart des C. elegans génome ^2,3 ouvert la voie à de véritables études génomiques fonctionnelles (voir, par exemple ^4-7), la plupart des méthodes établies sont laborieuses. Moy et ses collègues ont mis au point des protocoles semi-automatiques qui facilitent l'échelle du génome écrans ^8. L'approche repose sur l'imagerie microscopique et l'analyse d'image.

Nous décrivons ici un protocole alternatif pour un haut débit du génome, grand écran, basée sur la manipulation robotique de clones bactériens ARNi, une analyse quantitative à l'aide de la Biosort COPAS (Union Biometrica (UBI)), et unelogiciel intégré: l'MBioLIMS (Laboratory Information Management System de Modul-Bio) une technologie qui offre un débit plus élevé pour la gestion des données et le suivi des échantillons. Procédé permettant écrans à être effectuée sur des plaques de milieu solide. Ceci est particulièrement important pour certaines études, comme celles portant sur ​​les interactions hôte-pathogène dans C. elegans, car certains microbes ne sont pas efficacement infecter des vers dans une culture liquide.

Nous montrons comment la méthode peut être utilisée pour quantifier l'importance des gènes dans les anti-fongiques l'immunité innée dans C. elegans. Dans ce cas, l'approche repose sur l'utilisation d'une souche transgénique portant un épiderme infection inductible du gène rapporteur fluorescent, avec la GFP sous le contrôle du promoteur du gène du peptide antimicrobien de la PNL 29 et un journaliste en rouge fluorescent qui est exprimé de façon constitutive dans le épiderme. Celle-ci prévoit un contrôle interne pour l'intégrité fonctionnelle de l'épidermeet non spécifique du transgène taire ^9. Lorsque les vers de contrôle sont infectées par le champignon, ils émettent une fluorescence verte. Abattre par ARNi d'un gène requis pour des résultats nlp expression 29 de fluorescence diminuée après l'infection. Actuellement, ce protocole permet à plus de 3000 clones d'ARNi à être testé et analysé par semaine, ouvrant la possibilité de filtrer l'ensemble du génome en moins de 2 mois.

Protocol

Le protocole tel que décrit ci-dessous est divisée en étapes de cinq jours successifs (Fig. 1). Comme indiqué précédemment, certaines mesures peuvent être effectuées sur des jours différents. La durée de chaque étape, ainsi que la quantité de matériel requis (par exemple les vers, les bactéries, les médias) dépendra du nombre de plaques à 96 puits traitées par expérience. Jour 1 1. Préparation des plaques à 96 puits ARNi NGM Le protocole suivant est adapté de la méthode standard pour la fabrication de plaques de culture à vis sans fin 10, qui comprend des détails sur les techniques de stérilisation pour les différentes solutions. Pour 10-12 plaques à 96 puits, préparer 100 ml de milieu de croissance des nématodes (NGM) dans désionisée H 2 O: 1,7 g BactoAgar, 0,29 g de NaCl, 0,25 g Peptone, 100 ul de cholestérol (5 mg / ml dans EtOH). Autoclave NGM (5 min à 121 ° C pour 100 ml, 30 min à 121 ° C pendant 4 L) et le laisser refroidir jusqu'à ce qu'il soit à environ 50 ° C (juste cool enough à tenir). Il est important que le NGM reste assez chaud pour qu'il ne se solidifie pas. Ajouter 100 ml d': 2,5 ml de tampon phosphate pH 6 (1M), 100 pl MgSO 4 (1M), 100 ul de CaCl 2 (1M), 400 ul IPTG (1M), 100 pl ampicilline (100 mg / ml), 100 ul tétracycline (12,5 mg / mL dans EtOH). Distribuer 75 uL de NGM dans chaque puits d'un à 96 puits à fond plat plaque. Pour éviter la solidification du milieu, elle doit être distribuée rapidement; il est commode d'utiliser un distributeur répétitif (par exemple Repeatman, Eppendorf). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air présentes dans les puits. Stocker les plaques immédiatement dans une chambre humide (par exemple une boîte de Tupperware avec des serviettes en papier humide en bas) à 4 ° C. Note: Les plaques peuvent être préparés jusqu'à une semaine à l'avance et stocké à 4 ° C, ce qui peut rendre l'organisation plus facile des étapes ultérieures. 2. Préparation automatisée des plaques LB 96-DeepWell <li> Préparer et distribuer 1,5 ml de LB contenant Ampicilline 100μg/mL et la tétracycline 12,5 ug / ml dans chaque puits d'une plaque Deepwell 96-qui a une capacité maximale de 2 ml / puits. La distribution est optimisée grâce à un système de manipulation robotisé liquide (par exemple TECAN), mais peut également être effectuée manuellement si nécessaire. Ajouter une couverture pour chaque plaque et conserver à 4 ° C. Afin de suivre chaque plaque de 96 puits, une étiquette code à barres unique ou doit être ajouté, à ce stade ou ultérieurement. Note: Les plaques peuvent être préparés 2 à 3 jours à l'avance et stocké à 4 ° C, ce qui peut rendre l'organisation plus facile des étapes ultérieures. 3. Cultiver les clones bactériens ARNi dans les plaques LB 96-Deepwell (culture de la nuit) Pour faciliter la suite de la manipulation, lorsque les originaux ARNi clones de la banque sont dans un format de 384 puits, de redistribuer d'abord les clones dans étiquetés ou un code-barres standard T plaques à 96 puits contenant LB avec 100 pg / mL Amp et 12,5 ug / mlet complété avec le glycérol (10% en concentration finale). Lorsque les planches originales de 384 puits n'ont pas clones dans tous les puits, comme c'est le cas pour le plus couramment utilisé "Ahringer« bibliothèque, il existe plusieurs options pour organiser les plaques filles. Les clones peuvent être re-distribué afin qu'il n'y ait pas de puits vides dans les plaques filles. Cela réduit le nombre de plaques à l'écran. Idéalement, toutefois, lors de la réplication, quelques puits sur chaque plaque fille doit être laissée vide, de sorte que ceux-ci peuvent ensuite être rempli avec des clones de contrôle standard (positives et négatives) qui facilitent travers de plaques comparaisons. Ces plaques fille de 96 puits sont ensuite utilisés pour ensemencer les plaques LB 96-DeepWell pour une nuit (ON) la culture. Toutes les étapes de manipulation des liquides sont le mieux fait avec un système de manipulation de liquides robotique (par exemple Tecan), mais peut être réalisée manuellement à l'aide, par exemple, un réplicateur de 96-pin. Si les clones d'ARNi de la bibliothèque sont déjà dans un format de 96 puits passez à l'étape 3.5. <odébut l = "2"> Incuber les plaques à 96 puits fille ARNi à 37 ° C avec agitation (200 rpm) pendant 14-15 heures. Vérifiez que les bactéries croissent correctement et identifier des clones qui ne poussent pas. Ceux-ci seront exclus des analyses ultérieures. Idéalement, la DO 600 est mesurée dans chaque puits, mais cela peut être fait par simple inspection. Stocker les plaques à 96 puits fille ARNi à -80 ° C avant utilisation. Décongeler les plaques à 96 puits contenant les clones ARNi à la température ambiante. Les plaques peuvent ensuite être conservé à 4 ° C jusqu'à son utilisation. Distribuer 3 ul de chaque clone bactérien à partir d'une plaque de 96 puits répliquer aux 96 puits de la plaque LB 96-Deepwell conséquence étiquetés / code à barres contenant 1,5 mL de LB avec 100 pg / mL Amp et 12,5 ug / ml Tet. Clones bactériens pour contrôler l'efficacité ARNi, comme un gfp (ARNi) clone dans le présent exemple, et les contrôles négatifs, peuvent être incorporés manuellement dans un puits vide disponible. Couvrir la p 96-Deepwelllates avec un film adhésif (par exemple film AeraSeal la culture cellulaire à partir d'Dutscher). Remplacer la plaque de 96 puits utilisé réplique à -80 ° C. Les plaques 96-DeepWell marqués sont ensuite incubés ON à 37 ° C avec agitation (200 tours par minute pendant 14-15 heures). Jour 2 4. Semences des clones bactériens ARNi sur les plaques à 96 puits ARNi NGM Cette étape doit être fait dans la matinée à la suite de la culture sur ON. Prenez les plaques à 96 puits NGM de 4 ° C et laissez-les se réchauffer et sécher pendant 5-15 min sous une hotte à flux laminaire stérile. Ne laissez pas les plaques trop longtemps sous le capot (maximum 30 min), sinon le NGM peut ensuite se fissurer. Ajouter l'étiquette appropriée / code à barres pour chaque plaque. Récupérez le 96-Deepwell SUR plaques de culture à partir de 37 ° C. Enregistrer les positions de tous les puits vides (un puits vide est complètement translucide); ceux-ci seront exclus des analyses ultérieures. Centrifuger le 96-Deepwell plaques 5 min à 4000 rpm. Embout le surnageant en tournant la plaque fortement à l'envers et sécher les bords de la plaque rapidement sur une serviette en papier. Comme les cultures sont des bactéries recombinantes, le surnageant doit être traitée en conformité avec les réglementations locales (par exemple à l'autoclave). Remettre en suspension le culot bactérien dans le liquide résiduel (environ 50 pi) au vortex, idéalement à l'aide d'un agitateur dédié (par exemple Tecan) de telle sorte que chaque plaque reçoit précisément le même traitement. Il est possible de mesurer la DO 600 de chaque puits de standardiser précisément l'inoculum bactérien pour l'étape ultérieure, mais ce n'est pas indispensable, et nous n'avons pas effectuer une telle vérification. Transférer 5 pl des bactéries remises en suspension sur les plaques à 96 puits NGM l'aide d'un 8 ou 12 canaux multi-pipette. Veillez à ne pas toucher ou pénétrer dans le NGM. Cette étape est effectuée manuellement, mais peut être optimisé en utilisant un robot tel que le Liquidator96 (Rainin) qui permet à l'la distribution de 96 clones ARNi en une seule étape. Que les bactéries sec sous une hotte à flux laminaire stérile, vérifier régulièrement pour éviter la NGM devenir trop sec. Cette étape devrait prendre environ 2 heures. Incuber les 96 et RNAi-NGM plaques à 37 ° C ON dans une chambre humide. 5. Préparer une population de synchronisation vers Pour cette étape, nous utilisons les vers transgéniques portant le gène rapporteur (s) d'intérêt (par exemple une infection p-inductible nlp-29 :: GFP construction et, comme un contrôle interne, un col constitutive p-12 :: DsRed transgène) . En raison de la diminution observée de l'expression du transgène avec le temps, nous dégeler lots frais de vers toutes les 6 semaines. Vers la culture qui nous concerne, au moins 2 générations avant utilisation, et veiller à ce que les vers n'ont jamais faim avant le dosage. Si le jour 2 du protocole est le mardi, nous préparons vers le vendredi 30 en plaçant des vers adultes jeunes sur une plaque de 9 cm NGM répandre avec OP50 bactériesà 20 ° C, ils seront prêts à l'eau de Javel, le mardi (voir tableau 1). Vers l'eau de Javel après le protocole standard 10. Laissez les oeufs éclosent au bout de M9 à 25 ° C avec agitation ON pour obtenir une population de larves L1 synchronisée. Jour 3 6. Distribuer les vers sur les 96-et-ARNi NGM plaques pour l'alimentation et l'ARNi Cette étape doit être fait dans la matinée. Vers L1 au stade synchronisées sont distribués sur chaque clone de 96 puits bactérienne pour l'alimentation et l'ARNi. Récupérez les 96 et RNAi-NGM plaques de 37 ° C et les laisser à température ambiante pour refroidir. Récupérer les vers blanchie à partir de 25 ° C. Estimer le nombre de vers par 2 pi et d'ajuster avec M9 d'avoir autour de 100-120 vers par 2 pi (environ une seule goutte). Distribuer manuellement 2 pi de L1 au stade des vers dans chaque puits en utilisant un distributeur répétitif. Vérifiez chaque puits pour les vers (vous devriez voir des vers de natation dans un liquide). Laissez les plaques sec sous une hotte à flux laminaire stérile (maximum 1 heure). Vérifiez les plaques régulièrement, les vers doivent être ramper et ne pas nager. Soyez prudent, le NGM ne doit pas sécher trop, sinon il va se fissurer. Placez les plaques à 25 ° C dans une chambre humide. 7. Testez les spores Drechmeria coniospora pour l'infection efficace Cette étape est spécifique pour l'écran présente. Il consiste à tester les différents lots de spores pour sélectionner ceux très infectieux. Par conséquent, il devrait être fait aussi près que possible avant le jour 4, le jour de l'infection. Il est nécessaire de préparer suffisamment de L3-L4 vers à l'avance pour ces tests (tableau 1). Les méthodes détaillées requises pour D. la culture coniospora ont été décrites ailleurs 11. <ol> Recueillir les spores d'un échantillon de chaque culture fongique dans un petit volume de M9. Déposer une goutte de chaque suspension de spores sur une plaque de 35 mm NGM ensemencé avec OP50, et laissez sécher. Ajouter 30-40 L3-L4 vers porteurs du gène rapporteur de l'intérêt (par exemple p nlp-29 :: GFP). Placez les plaques infectées à 25 ° C SUR. Le lendemain, vérifiez les vers pour l'induction de la GFP et sélectionner le lot de champignon qui donne les plus brillants, l'induction la plus large et plus homogène de la fluorescence verte. Jour 4 8. Infect l'ARNi vers exposée avec D. spores coniospora Cette étape est réalisée 30 heures après l'ARNi nourrir lorsque les vers ont atteint le stade L3-L4. Déterminer le volume de spores à utiliser pour distribuer 4 pi par puits. Recueillir frais D. spores coniospora du lot sélectionné avec le tampon M9. Utilisez 8-10 ml de M9 pour un 9 Plaque cm de spores. <li> Distribuer 4 pi de spores dans chaque puits avec un distributeur répétitif. Vérifiez chaque puits pour les spores (vous pouvez voir la piscine vers dans un liquide). Laissez les plaques sec sous une hotte à flux laminaire stérile (~ 1 heure). Vérifiez les plaques régulièrement jusqu'à ce que les vers commencent à ramper. Soyez prudent, le NGM ne doit pas sécher trop, sinon il va se fissurer. Placez les plaques infectées à 25 ° C dans une chambre humide. Jour 5 9. Observation et de stockage des plaques avant l'analyse quantitative automatisée Cette étape démarre 18 heures après l'infection et est effectuée durant la journée 5. Worms sont censés être les jeunes adultes commencent à pondre des œufs. Au cours de cette étape, le phénotype est marqué visuellement: soit vers une fluorescence verte qui correspond à une infection situation normale à la suite, ou l'induction de la GFP est altérée dans un puits donné ce qui signifie que les modifications géniques silencieux de la réponse à l'infection. <li> Rapidement observer les plaques au microscope à fluorescence dissection. Si les plaques montrent une induction GFP intérêt général, puis passez à l'étape suivante, sinon attendre l'après-midi pour une meilleure induction, aussi longtemps que il ya encore de la nourriture pour les vers à gauche. Visuellement marquer chaque plaque et noter toute bien avec un phénotype marqué (par exemple, aucune expression de la GFP). En vérifiant les résultats obtenus avec des clones d'ARNi de contrôle qui peuvent avoir été ajoutés, cette première analyse préliminaire donne une indication de savoir si l'expérience a été couronnée de succès. L'utilisation d'un 8 ou 12 canaux multi pipette de transfert des vers avec 100 ul de NaCl 50 mM-Triton 0,05%, à une nouvelle en conséquence étiquetés / code à barres de 96 puits à fond rond plaque. Congeler les plaques à -80 ° C jusqu'à l'analyse. Le jour de l'analyse, dégeler les plaques à température ambiante et de procéder à l'analyse automatisée en utilisant l'Biosort COPAS. La trieuse analyse d'une seule plaque en 22 minutes. Elles ne doivent pas êtrelaissé à température ambiante pendant plus d'une heure avant l'analyse, et ils ne peuvent pas être recongelé. L'information obtenue à partir du Biosort COPAS sont transcrites dans un fichier Excel pour la vérification rapide de la qualité des données. Les données brutes avec les différents paramètres mesurés par le Biosort COPAS (densité optique (extinction), la longueur axiale (temps de vol), les émissions de fluorescence, simultanément par trois différents détecteurs) sont ensuite stockés dans un paquet dédié LIMS (MBIO LIMS, Modul- Bio) pour la suite analyses quantitatives détaillées. 10. Les résultats représentatifs Avec les quantités de vers et les bactéries indiquées ci-dessus, à la fin de l'expérience, dans la plupart des puits, les animaux doivent tous ont mis au point à l'âge adulte et il devrait toujours être un peu de nourriture laissée dans tous les puits. Dans ces conditions, la plupart des puits devrait également contenir des oeufs. Il devrait y avoir un nombre suffisant d'adultes dans chaque puits de telle sorte que les données sont obtenues Biosort fou au moins 50 vers individuels. D'autre part, si l'ARNi est efficace, un grand nombre de clones d'ARNi va provoquer un phénotype visible. Par exemple, les vers peuvent être coordonnés, ou plus de toute évidence, stérile, ou arrêtés dans leur développement. Cela devrait se produire fréquemment, de sorte que généralement au moins un puits par plaque de 96 puits contient des vers avec un phénotype évident ARNi. Lorsque le phénotype d'intérêt est l'expression d'un gène rapporteur GFP, les puits avec un gfp (ARNi) clone de fournir un contrôle robuste (fig. 2). Phénotypes autres, comme une altération de la taille peut être facilement mesurée avec le Biosort (figure 3A). Nous avons observé que les vers pourraient migrer vers les puits adjacents à très basse fréquence (<1%, BS, résultats non publiés) quand la nourriture dans un endroit bien ne s'épuisent. Abattre la fonction des différentes classes de gènes peuvent affecter l'expression de transgènes dans C. elegans. Certains sont non-spécifiquement requis pour l'expression des transgènes 12. D'autres, telscomme facteurs de transcription spécifiques de tissu, par exemple le facteur GATA-3 épidermique ELT 13, sera nécessaire dans certains sous-ensembles de cellules. C'est une des raisons pour l'inclusion d'une personne non apparentée et constitutive construction épidermique de cellules journaliste transgène (p col-12 :: DsRed) dans la souche utilisée pour le protocole actuel. Cela permet à ces gènes se distinguent de celles spécifiquement impliqués dans le processus de régulation génique à l'étude (Fig. 3B & C). Ce transgène est exprimé à tous les stades larvaires. Si un test implique l'expression des gènes dans les embryons de détection d'un gène de contrôle différent journaliste serait nécessaire. L'une des innovations de ce protocole est l'utilisation de plaques de gel de reporter leur analyse. La congélation permet plaques doit être stocké pendant jusqu'à deux semaines sans modifier sensiblement les résultats. Bien que les valeurs absolues de fluorescence mesurée peut être changé, leurs ratios relatifs restent similaires (Fig. 4). Sur le otsa main, l'ARNi est un 14 Procédure intrinsèquement variable expérimentale. Pour obtenir des résultats robustes et d'éliminer les nombreux faux positifs potentiels, écrans ARNi doivent être reproduits, au moins une fois. Si les expériences sont menées avec succès, il devrait y avoir une corrélation raisonnable entre les résultats d'une plaque testée sur des jours différents. En particulier, les gènes qui ont un fort effet doit être clairement identifiable, même si leur effet quantitatif précis n'est pas identique entre les plaques en double (Fig. 5). Figure 1. Plan d'ensemble pour une expérience typique. Figure 2. Contrôle ARNi en utilisant un clone de ciblage expression de la GFP. Vers transgénique expressing constitutivement ap col-12 :: journaliste DsRed et une inductible p nlp 29 :: rapporteur GFP sur milieu solide dans une plaque de 96 puits visualisées en utilisant un microscope à dissection GFP avec un ensemble de filtres permettant l'observation simultanée de la fluorescence rouge et vert. Worms ont été exposés à contrôler (panneaux supérieurs) ou un clone GFP ARNi (panneaux inférieurs) pendant 48 h. Les panneaux sur la gauche sont des vers non infectées, ces bons sur les vers 18 heures après l'infection par D. coniospora. La barre d'échelle est de 1 mm. Figure 3. L'analyse quantitative d'une plaque de 96 puits. Le Biosort COPAS génère des données numériques pour chaque ver analysés. Les graphiques montrent l'écart moyen et standard pour le temps de vol (TOF; A) qui correspond à la taille de la vers 15, fluorescence rouge (B) et le rapport (X100) de la fluorescence verte pour TOF (C) de la transgénique worms exprimant constitutivement ap col-12 :: journaliste DsRed et une inductible p nlp 29 :: rapporteur GFP qui avaient été cultivées sur un milieu solide dans une plaque de 96 puits avec différents clones ARNi pour 48 h, 18 heures après l'infection par D. coniospora. Certains clones, tels que celui mis en évidence par la flèche (A), des défauts de croissance provoquent et / ou affecter l'expression de p col-12 :: DsRed. D'autres, affectent en particulier les expression de la GFP, comme l'a souligné par la flèche (C). Ce clone particulier vise la NSY gène 1, connu pour être important pour la régulation de la PNL 29 13. Vert, rouge fluorescence et TOF sont mesurés en unités arbitraires, mais constante. Figure 4. CompArison des données obtenues avec des échantillons vivants et congelés de la même expérience. Plaques de L4 vers transportant p nlp-29 :: GFP et p col-12 :: transgènes DsRed ont été soit infectés par le D. coniospora ou non. Après 18h, chaque plaque a été à peu près divisé en 2, dont la moitié a été analysé immédiatement et l'autre moitié congelés à -80 ° C pendant 24h, avant le dégel et l'analyse. Les valeurs de moyenne TOF (taille de vers), EXT (densité optique) et la fluorescence verte et rouge ont été calculés pour chaque échantillon. Le graphique montre le ratio de la moyenne pour les personnes infectées divisé par non-infectés échantillons, pour les échantillons congelés et en direct (n = 7638 et 5096, et 8634 et 3850 vers, respectivement). Figure 5. L'analyse comparative des doublons plaques à 96 puits. Le rapport de fluorescence normalisée (le rapport de fluorescence moyenne (ici, 100 * vert / TOF) pour chaque puits, divisé parle coupé (25 e à 75 e percentile) signifie pour chaque plaque) pour chaque puits à partir d'analyses en double d'un représentant plaque de 96 puits. Matériel Chronologie expérimentale IPTG: ~ 1,4 ml Ampicilline: ~ 5 ml Tétracycline: ~ 5 ml LB: 5 L Plaques à 96 puits plats: 30 pour NGM Plaques à 96 puits ronds: 30 pour la congélation (analyse) 96-DeepWell plaques: 30 pour la culture ON la culture cinématographique: 30 Conseils boîte: 30 pour l'ensemencement des bactéries 9 cm OP50 plaques: ~ 17 Worms: 1 fraîchement dégelé cyrovial par mois Spores: ~ 2 plaques NaCl 50 mM + Triton 0,05%: ~ 300 ml Jeudi Préparer l'ARNi NGM plaques à 96 puits (~ 1h + autoclave) Vendredi Préparer les plaques LB 96-Deepwell (~ 4h) Préparer les vers (14 plaques avec 30 vers adultes jeunes à 20 ° C + 1 plaque à 25 ° C) Lundi Transfert vers de plaque à 25 ° C sur la plaque de nouvelle Distribuer des bactéries dans des plaques de LB (~ 7h) Sur la culture, 18 heures Mardi Distribuer des bactéries sur des plaques de NGM du matin (3h+ De 2h de ~ séchage) Vers l'eau de Javel à partir de plaques à 20 ° C Mercredi Distribuer des vers à 10 h (~ 1h + 1h de ~ séchage) Spores d'essai avec les vers de la plaque à 25 ° C Jeudi Infect vers à 15 heures (~ 1h + 1h de ~ séchage) Vendredi Transfert en plaques à 96 puits + gel (~ 2h) nouvelle Tableau 1. Exemple d'une expérience d'un cycle avec 30 plaques. Ici est présenté le matériel nécessaire pour une expérience d'un cycle de 30 plaques et un calendrier pour une expérience de l'étape 1 à l'étape 12 a organisé le 9 jours. Les milieux de croissance des nématodes (NGM), 100 ml: 0.3 g NaCl 0,25 g Bactopeptone 2 g BactoAgar 100 pi 5 mg / ml cholestérol dans EtOH Ajouter de l'eau déminéralisée à 100 ml Autoclave pour 5 minutes à 121 ° C et laisser refroidir, puis ajouter: 100 pi M 1 MgSO 4 100 pi M 1 CaCl 2 2,5 ml 1 M 6,0 KPO pH 4 NGM pour le traitement RNAi dans la plaque de 96 puits, 100 ml: 0,29 g NaCl 0,25 g Bactopeptone 1,7 g BactoAgar 100 pi 5 mg / ml cholestérol dans EtOH Ajouter de l'eau désionisée à 100 ml Autoclave pour 5 minutes à 121 ° C et laisser refroidir, puis ajouter: 100 pi M 1 MgSO 4 100 pi M 1 CaCl 2 2,5 ml 1 M 6,0 KPO pH 4 400 pi M 1 IPTG 100 pi 100 mg / ml ampicilline 100 pi 12,5 mg / ml de tetracycline L'eau de Javel, 5 ml: 2,5 ml H 2 O 2,3 ml de javellisant 0,2 ml de NaOH 50% NaOH 50%, 100 ml: 50 g de NaOH Ajouter de l'eau déminéralisée à 100 ml NaCl 50 mM-Triton 0,05%, 400 ml: 4 ml de NaCl 5 M 1 ml de Triton 20% Ajouter de l'eau déminéralisée à 400 ml tep "> Triton 20%, 10 ml: 2 ml de Triton X-100 8 ml d'eau déminéralisée M9 tampon, 1L 6 g de Na 2 HPO 4 (MW: 178) 3 g de KH 2 PO 4 (PO: 136) 5 g de NaCl Ajouter de l'eau déminéralisée pour 1 L Autoclave Ajouter 1 mL MgSO 4 1 M Luria Broth (LB), 1L: 10 g bactotryptone 20 g Extrait de levure 10 g de NaCl Ajouter de l'eau déminéralisée pour 1 L Autoclave 1 M MgSO 4, 300 ml: 73,95 g MgSO 4 Ajouter de l'eau déminéralisée à 300 ml Autoclave et conserver à température ambiante 5 mg / Cholestérol ml, 200 ml: 1 g Cholestérol Ajouter EtOH à 100% à 200 ml Filtrez stériliser et stocker à température ambiante 1 M CaCl 2, 500 ml: 27.75 g de CaCl 2 Ajouter de l'eau déminéralisée à 500 ml Filtrez stériliser et stocker à température ambiante 1 M KPO 4 pH 6.0, 4 L: 517 g de KH 2 PO 4 (PO: 136) 207 g de K 2 HPO 4 (MW: 174) Ajouter de l'eau déminéralisée à 4 L 100 mg / ml d'ampicilline (Amp), 10 ml: 1 g ampicilline Ajouter de l'eau déminéralisée à 10 ml Conserver à -20 ° C 1 M isopropylique β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml: 2,38 g d'IPTG Ajouter de l'eau déminéralisée à 10 ml Conserver à -20 ° C 12,5 mg / ml de tétracycline, 100 ml 1,25 g de tétracycline Ajouter EtOH à 100% à 100 ml Tableau 2. Solutions.

Discussion

<p class="jove_content"> Le protocole actuel permet dépistage à grande échelle dans l'ARNi<em> C. elegans</em> Sur un milieu solide, en utilisant le niveau d'expression d'un gène rapporteur fluorescent en tant que lecture. Il a été optimisé avec des outils automatisés pour faciliter tests à haut débit, permettant une manipulation facile et rapide d'un grand nombre d'échantillons, d'une manière efficace, fiable et reproductible. D'autres méthodes ont été décrites qui ne reposent pas si lourdement sur la manipulation automatisée des échantillons de liquide⁸.</p><p class="jove_content"> Un aspect clé de l'organisation au protocole a été le développement d'une méthode robuste de suivi des échantillons, en adaptant le logiciel commercial MBioLIMS à la procédure de l'écran ARNi en collaboration avec le ModulBio entreprise. À chaque étape de la procédure, les plaques sont désormais identifiés par un code barre généré dans le LIMS. Comme le LIMS enregistre également l'identité des clones dans chaque puits sur chaque plaque, allant de bien à gène putatif est simple. Et au-delà de cela, les liens LIMS à la base de données WormBase communauté, permettant un accès direct à des données moléculaires et fonctionnelles sur un gène donné. Le LIMS facilite également les analyses à effectuer sur la plaque ou même au niveau des chromosomes et du génome entier. Pour ces analyses, les données sont stockées d'une manière qui est tout à fait compatible avec les outils décrits précédemment comme COPAmulti¹⁶.</p><p class="jove_content"> Un point critique dans la méthode expérimentale est l'ajustement de la quantité de nourriture par rapport au nombre de vers. Pour de nombreux tests, il est essentiel que les vers ne meurent pas de faim à la fin de l'expérience, mais il est également important de ne pas avoir trop de nourriture au début. Nous avons observé qu'une forte densité de nourriture diminue l'induction de fluorescence dans le protocole en utilisant des vers portant le p<em> Nlp-29</em> :: Rapporteur GFP. Cela peut refléter une diminution de l'efficacité d'infection lorsque les vers sont cultivées dans des bactéries trop (BS, résultats non publiés). Dans le même temps, les conditions de culture de la bactérie ARNi est également important, car cela détermine si ARNdb est produite à un niveau optimal. Certains protocoles à grande échelle exigent l'ARNi culture de clones ARNi sur gélose avant l'ensemencement des cultures liquides⁸. Nous avons obtenu gene silencing robuste en omettant cette étape. Nous avons opté pour un excès de croissance de chaque culture pour assurer des résultats homogènes. Le protocole décrit prévoit en effet suffisamment de matière pour effectuer 2 ou 3 écrans en parallèle. Dans l'intérêt d'obtenir les résultats les plus robustes, nous privilégions, cependant, la réalisation d'écrans en double en utilisant des cultures indépendantes de vers, bactéries et spores fongiques ARNi.</p><p class="jove_content"> Une autre étape essentielle est liée à l'utilisation de moyennes qui ne soit ni trop humide ni trop sec. Si les plaques ne sont pas assez sèches, la bactérie ARNi ne se dessèche pas correctement et les vers de se baigner pendant l'essai. Cela peut causer des problèmes. Par exemple, les vers ne sont pas efficacement infectées par le<em> D. coniospora</em> Dans un liquide (C Couillault, résultats non publiés). D'autre part, dans des plaques sèches, l'osmolarité du milieu augmente la culture. Cela a des effets directs sur la physiologie ver¹⁷, Comprenant l'induction de certains gènes peptides antimicrobiens, tels que<em> 29 nlp</em>¹⁸. Le volume utilisé pour distribuer les vers et les spores est essentielle pour permettre un séchage efficace et rapide. Si plus de 10 uL de liquide est ajouté à des plaques fraîches, les puits peuvent prendre plusieurs heures pour sécher. Cela peut signifier qu'il est difficile d'utiliser des méthodes robotiques pour ajouter des vers sur les plaques. Par exemple, chaque ver est distribué par le Biosort dans l'ordre de 1 pl de liquide. Nous distribuons actuellement les vers manuellement que nous permet aussi de surmonter la tendance de vers en solution dans les sédiments.</p><p class="jove_content"> Nous avons déjà indiqué un ajustement de la Biosort qui permettrait à une plaque de 96 puits à analyser en 36 minutes¹⁹. Fabricant de la machine UBI offre maintenant une modification de la Biosort à diminuer encore le temps d'analyse. Avec le "FastReFlex", les échantillons sont directement acheminé à travers la cellule d'écoulement pour l'analyse, en contournant le filtre à bulles-piège. Il en résulte une réduction significative du temps d'acquisition de données; une plaque entière peut être analysé en 22 min permettant d'environ 20 plaques à traiter par jour. Si les plaques ne sont pas gelés, cependant, il y aurait un intervalle de 8 heures entre les premiers et le dernier. Étant donné la durée relativement courte de l'expérience, avec l'infection qui dure seulement 18 heures, cela pourrait introduire une variable inacceptable dans les plaques. Non seulement les plaques de gel avant l'analyse résoudre ce problème, mais il est également essentiel dans le contexte de l'analyse à haut débit que, avec le protocole standard actuel et de manutention de liquides robots, 2 personnes peuvent facilement traiter jusqu'à 50 plaques par semaine. Actuellement, nous avons l'habitude d'écran 30 plaques par semaine, ce qui permet un écran l'ensemble du génomedoivent avoir lieu en moins de 2 mois.</p><p class="jove_content"> Une caractéristique intéressante de ce protocole est le fait qu'il utilise la gélose solide, permettant des dosages qui ne peuvent être réalisées en milieu liquide. Comme la physiologie ver diffère selon les conditions de culture^20,21, Être capable de réaliser des tests sur milieu solide peut également compléter habituelles à base de liquide écrans. Pour certains phénotypes (par exemple le mouvement), l'analyse peut être effectuée directement avec des plaques de milieu de 96 puits solides. Pour l'écran actuel, cependant, que le Biosort ne pouvons pas échantillonner à partir des plaques de milieu solide, les vers sont d'abord transférés à l'état liquide avant de le congeler. D'autre part, le Biosort COPAS permet une analyse multiparamétrique quantitative compatible avec la mesure de nombreux phénotypes différents. Il est probable que, pour n'importe quel écran donnée ne sont pas tous les paramètres mesurés sera le premier de lecture. Néanmoins, ces mesures peuvent être utiles pour plusieurs raisons. Ils permettent de déterminer si le dosage se sont déroulées correctement. Par exemple, on peut vérifier sur le nombre et la taille des vers dans chaque puits. Ce n'est que lorsque un clone ARNi devrait bloquer la croissance ou la reproduction doit y avoir un écart par rapport aux valeurs attendues. Wells avec moins de 20 vers ou / et des animaux 30% plus petites (TOF) par rapport à un stanstandard de contrôle sans effet sur la croissance (<em> Par exemple GFP (ARNi</em>)) Peuvent être exclus des analyses ultérieures. La fonction de ces clones peuvent être traitées en utilisant un protocole alternatif dans lequel les vers sont exposés à des bactéries ARNi après leur développement est bien avancé¹⁵. Les différents paramètres peuvent également être utilisés pour affiner gène candidat (hit) de sélection, par exemple, limiter coups seulement à ceux qui ont une incidence fluorescence verte, mais pas rouge. La méthode choisie pour la sélection précise succès dépendra du type d'écran et de son exacte de lecture. Compte tenu de la complexité des données générées à partir d'un génome quantitative, grand écran, la collaboration avec un statisticien peut être nécessaire.</p><p class="jove_content"> Le protocole que nous décrivons peut être facilement adaptée à d'autres types de tests. Par exemple, lors de l'étape d'infection<em> D. coniospora</em> Pourrait être remplacé par n'importe quel autre agent pathogène capable d'infecter sur des supports solides. Ce peut être utile comme nous l'avons constaté que bon nombre des facteurs de virulence importants pour l'infection à Serratia marcescens dans une culture liquide ne jouent pas un rôle lors de l'infection en milieu solide (E. Pradel, communication personnelle). Le protocole est également totalement compatible avec les tests de composés chimiques^22-24, Ou pour identifier des composés à la bioactivité l'utilisation de bibliothèques différentes de bactéries²⁵, Devrait donc trouver une utilité générale dans le<em> C. elegans</emCommunauté de la recherche>.</p

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
BactoAgar	BD Diagnostic Systems	214010
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
BactoPeptone	BD Diagnostic Systems	211677
CaCl2	Any supplier
AeraSeal adhesive film	Dutscher	760214
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Scientific	AB-0481
K2HPO4	Any supplier
KH2PO4	Any supplier
MgSO4	Any supplier
NaCl	Any supplier
Na2HPO4	Any supplier
NaOH	Any supplier
96 deep well plate	Thermo Scientific	AB-0932
96 well flat plate	FALCON	353072
96 well round plate	FALCON	353077
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T8032
Triton X-100	Any supplier
TECAN robot	TECAN
Liquidator96TM	RAININ
COPAS Biosort	Union Biometrica
LIMS	Modul-Bio