ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות
Summary
כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ"ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).
Abstract
Parvoviruses מכרסמים (PV) כגון עכברים H-1PV ו MVM, הם קטנים, בודדים icosahedral תקועים, נגיפי DNA. הגנום שלהם כוללת שני היזמים P4 ו p38 המסדירות את הביטוי של חלבונים בלתי מבניים (ns1 ו NS2) ו capsid (VP1 ו VP2) בהתאמה 1. הם מושכים אליהם ריבית גבוהה כסוכנים נגד סרטן עבור יכולות oncolytic ו oncosuppressive שלהם בעת היותו פתוגניים לא עבור בני אדם 2. Ns1 הוא מפעיל מרכזי של 3 cytotoxicity ויראלי. על מנת לשפר עוד יותר את פעילות antineoplastic הטבעיים, נגזרים מתוך וקטורים אלו נוצרו על ידי החלפת קידוד הגן החלבונים AAV עם transgene טיפולית (למשל ציטוטוקסיות פוליפפטיד, ציטוקינים chemokine, גן מדכא גידולים וכו ') 4. את parvoviruses רקומביננטי (recPVs) וקטור שומרת לעצמה את ns1 / 2 רצפי קידוד והטלומרים הגנום PV אשר הדרושים הגברה DNA אריזה ויראלי. הייצור שלrecPVs מתרחשת רק בתאי היצרן (בדרך כלל HEK293T), על ידי שיתוף transfecting את התאים עם וקטור 2 (pCMV-VP) להביע את הקידוד הגנטי של חלבונים סמנכ"ל (איור 1) 4. הווקטורים recPV שנוצר באופן זה הם שכפול פגום. למרות recPVs הוכיח בעל פעילות oncotoxic משופרות ביחס וירוסים הורים שממנו הם נוצרו, הייצור שלהם עדיין מהווה אתגר מרכזי מאוד מעכבת את השימוש של סוכנים אלה נגד סרטן יישומים קליניים.
מצאנו כי הכנסת וקטור Ad-5 המכיל נגזרת E2a, E4 (orf6) ואת רנ"א גנים נכי מלחמה (למשל pXX6 פלסמיד) אל HEK293T שיפור הייצור של recPVs על פי יותר מ 10 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. בהתבסס על ממצא זה, בנינו רומן Ad-VP-עוזר המכיל את המרכיבים הדרושים adenoviral גנטי כדי לשפר את הייצור recPVs כמו גם parvovirלנו סמנכ"ל הגן יחידה 5. השימוש Ad-VP-עוזר, מאפשרת ייצור של מלבן הכונן באמצעות פרוטוקול זה מסתמך אך ורק על מדרגות זיהום ויראלי (בניגוד transfection הפלסמיד), מה שהופך את השימוש האפשרי של שורות תאים שקשה transfect (למשל NB324K) ( איור. 2). אנו מציגים שיטה משפר באופן משמעותי את כמות וירוס רקומביננטי המיוצר, הן צמצום זמן הייצור בעלויות, מבלי להשפיע על איכות המוצר הסופי 5. בנוסף, ייצור בקנה מידה גדול של recPV (בתאים ההשעיה ו bioreactors) כיום להעלות על הדעת.
Protocol
Discussion
הראינו כי הייצור recPV ניתן לשפר על ידי נוכחות של אלמנטים הגנומי adenoviral. הגדלנו את התשואות על ידי recPV פי יותר מ 10 (מתא 0.3-5 / TU) על ידי מתן מרכיב גנטי adenovirus דרך transfection ועל ידי יותר מ -100 לקפל שיתוף מדביק תאים עם AD-עוזר, סמנכ"ל בשילוב עם recPV ב לעומת פרוטוקולים קונבנציונאלי. פרוט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות ההפקה וירוס DKFZ היחידה לפיתוח, במיוחד מרקוס מילר, סילביה Münstermann, ברברה Liebetrau, ואת מנדי רושר. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי משרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF) והאגודה הלמהולץ במסגרת Krebsforschungszentrum Deutsches / Cancéropôle du Grand-Est תכנית משותפת יישומי Tumour וירולוגיה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
- Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
- Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
- El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
- Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
- He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
- Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).
