Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l'aide d'adénovirus dérivés Systems
Summary
Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l'infection des cellules, ce qui améliore l'efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Ce protocole basé sur l'utilisation d'un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l'unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).
Abstract
Parvovirus des rongeurs (PV) comme chez le rat H-1PV et MVM, sont de petits icosaédrique, simple brin virus à ADN,. Leur génome comprend deux promoteurs P4 et P38 qui régulent l'expression des protéines non structurales (NS1 et NS2) et (capside VP1 et VP2), respectivement 1. Ils attirent un grand intérêt en tant qu'agents anticancéreux pour leurs capacités oncolytiques et oncosuppressive tout en étant non-pathogènes pour l'homme 2. NS1 est l'effecteur majeure du 3 cytotoxicité virale. Afin de renforcer davantage leurs activités naturelles antinéoplasiques, dérivés de ces vecteurs ont été générées par le remplacement du gène codant pour les protéines de la capside d'un transgène thérapeutique (par exemple un polypeptide cytotoxique, cytokine, une chimiokine tumeur du gène, suppresseur etc) 4. Les parvovirus recombinants (recPVs) vecteur conserve les séquences NS1 / 2 de codage et les télomères du génome qui sont nécessaires PV pour l'amplification d'ADN viral et l'emballage. La production derecPVs se produit uniquement dans les cellules productrices (générale HEK293T), par co-transfection des cellules avec un second vecteur (pCMV-VP) exprimant le gène codant pour les protéines VP (fig. 1) 4. Les vecteurs recPV générés de cette manière sont défectif pour la réplication. Bien que recPVs prouvé posséder une intensification des activités oncotoxic à l'égard des virus parentaux à partir de laquelle ils ont été générés, leur production reste un défi majeur et entrave fortement l'utilisation de ces agents dans la lutte contre le cancer des applications cliniques.
On a constaté que l'introduction d'un vecteur d'annonce-5 dérivée contenant l'E2a, E4 (orf6) et les gènes d'ARN VA (par exemple plasmide pXX6) dans HEK293T amélioré la production de recPVs de plus de 10 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Partant de ce constat, nous avons construit un roman Ad-VP-helper qui contient les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production recPVs ainsi que la parvovirnous VP gène unité 5. L'utilisation d'Ad-VP-helper, permet la production de recom-PV en utilisant un protocole qui repose entièrement sur les mesures infection virale (par opposition à la transfection de plasmide), ce qui rend possible l'utilisation de lignées cellulaires qui sont difficiles à transfecter (par exemple NB324K) ( Fig. 2). Nous présentons une méthode qui améliore considérablement la quantité de virus recombinant produit, réduisant à la fois le temps de production et les coûts, sans affecter la qualité du produit final 5. En outre, la production à grande échelle de recPV (dans les cellules en suspension et les bioréacteurs) est maintenant envisageable.
Protocol
Discussion
Nous avons montré que la production recPV peut être renforcée par la présence d'éléments génomiques adénoviraux. Nous avons augmenté les rendements recPV de plus de 10 fois (0,3 à 5 TU / cellule) en fournissant des éléments génomique adénovirus par transfection et de plus de 100 fois co-infectant les cellules avec Ad-VP-helper en combinaison avec le recPV dans Comparaison de protocoles conventionnels. Le protocole décrit ici peut être encore optimisée en déterminant le moment le plus approprié pou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l'équipe de la production de virus DKFZ et de l'unité de développement, en particulier Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, et Mandy Roscher. Cette étude a été partiellement financé par des subventions du Ministère fédéral de l'éducation et la recherche (BMBF) et l'Association Helmholtz dans le cadre de la Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Programme commun dans la tumeur appliquée virologie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
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