Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim
Summary
Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.
Abstract
Bu tür sıçan H-1PV ve MVM olarak Kemirgen parvoviruses (PV), küçük icosahedral, tek sarmallı DNA virüsleri vardır. Genom, sırasıyla 1, yapısal olmayan (NS1 ve NS2) ve kapsid proteinler (VP1 ve VP2) ile ifade düzenleyen iki arttırıcılar ve P4 P38 içerir. Onlar onkolitik ve oncosuppressive yetenekleri için antikanser ilaçları insanlar 2 için patojen olmayan olurken yüksek ilgi gördü. NS1 viral sitotoksisite 3 ana efektör olup. Daha da doğal antineoplastik aktiviteleri arttırmak amacıyla, bu vektörlerin gelen türevler bir terapötik transgen (örn., bir sitotoksik polipeptid, sitokin, kemokin, tümör baskılayıcı geni gibi) 4 ile kapsid proteinleri için kodlayan gen ile değiştirerek elde edilmiştir. Rekombinant parvoviruses (recPVs) vektör NS1 / 2 kodlama dizileri ve viral DNA amplifikasyonu ve paketleme için gerekli olan PV genom telomer korur. ÜretimirecPVs yalnızca tarafından üretici hücre (genellikle HEK293T), oluşur ko-transfekte VP proteinleri için kodlayan gen (Şekil 1) 4 eksprese eden ikinci bir vektör (pCMV-VP) ile hücre. Bu şekilde üretilen recPV vektörler replikasyon bozuk. RecPVs ürettikleri edilmiştir hangi ebeveyn virüsler açısından gelişmiş oncotoxic aktiviteye sahip olduğu ispat rağmen, bunların üretimi önemli bir sorun oluşturmaktadır ve güçlü anti-kanser klinik uygulamalarda bu ajanların kullanımı engellemektedir.
Bu kullanımda, diğer protokollere göre daha az 10 kat recPVs üretimi geliştirilmiş HEK293T içine E2A, E4 (orf6) ve VA RNA geni (örn. pXX6 plazmid) içeren bir Reklam-5 türetilmiş vektörün bir giriş bulundu. Bu bulgu, dayanarak, recPVs üretimi artırmak için gerekli olan genomik adenoviral elemanları gibi parvovir içerdiği Reklam-VP-yardımcı olan yeni bir inşaBizi VP gen ünitesi 5. Ad-VP-helper kullanımı, rec-PV üretimi ((örneğin NB324K) olası transferinde zor olan hücre hatlarının yapımı kullanımı, viral enfeksiyon adımları (as plazmid transfeksiyon aksine) tamamen güvenir bir protokolü kullanarak verir Şek. 2). Bu büyük ölçüde nihai ürün 5 kalitesini etkilemeden, üretim süresini ve maliyeti azaltarak, üretilen rekombinant virüs miktarını arttırır bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, recPV büyük ölçekli üretim (süspansiyon hücreleri ve biyoreaktörler) artık makuldür.
Protocol
Discussion
Biz recPV üretim adenoviral genomik elementin varlığını tarafından geliştirilmiş olabilir göstermiştir. Biz transfeksiyon ile adenovirüs genomik elemanı sağlayarak ve recPV ile kombinasyon halinde Reklam-VP-yardımcı ile 100 kat daha fazla eş-hücreleri tarafından enfekte 10'dan fazla kat (0,3-5 TU / hücreden) tarafından recPV verimleri artmıştır geleneksel protokollere karşılaştırılması. Protokol daha adenovirüs genomik elemanlarının teslimat ve enfeksiyonu için kullanılmak üzere Re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz özellikle Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau ve Mandy Roscher yılında, DKFZ virüs üretim ve geliştirme biriminin ekip teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Eğitim ve Araştırma (BMBF) ve Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Uygulamalı Tümör Viroloji ortak Programı çerçevesinde Helmholtz Topluluğu Federal Bakanlığı tarafından desteklenen hibe edilmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
- Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
- Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
- El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
- Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
- He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
- Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).
