Effektiv Rekombinant Parvovirus Produktion ved hjælp af adenovirusafledte Systems
Summary
Her beskriver vi en protokol baseret udelukkende på celle-infektion, hvilket forbedrer effektiviteten af rekombinant parvovirus produktion med mere end 100 gange i sammenligning med andre protokoller, der anvendes. Denne protokol er afhængig af anvendelsen af en hidtil ukendt adenovirus 5-baserede helper indeholdende parvovirus VP transkriptionsenhed (Ad-VP).
Abstract
Gnavere parvovirus (PV) såsom rotte H-1PV og MVM, er små ikosaedriske, enlige strandede, DNA virus. Deres genom omfatter to promotorer P4 og P38, der regulerer ekspressionen af ikke-strukturelle (NS1 og NS2) og capsidproteiner (VP1 og VP2) henholdsvis en. De tiltrækker store interesse som anticancermidler for deres onkolytiske og oncosuppressive evner og samtidig være ikke-patogene for mennesker 2. NS1 er den største effektor af viral cytotoksicitet 3. For yderligere at forbedre deres naturlige antineoplastiske aktiviteter er derivater fra disse vektorer blevet frembragt ved at erstatte det gen der koder for capsidproteinerne med et terapeutisk transgen (f.eks cytotoksisk polypeptid, cytokin, chemokin, tumorsuppressorgen etc.) 4. De rekombinante parvovira (recPVs) vektor bevarer NS1 / 2 kodende sekvenser og PV genom telomerer, der er nødvendige for viral DNA-amplifikation og emballering. Fremstilling afrecPVs kun forekommer i de producerende celler (sædvanligvis HEK293T) ved co-transfektion af celler med en anden vektor (pCMV-VP), der udtrykker genet, der koder for VP proteiner (fig. 1) 4. De recPV vektorer genereret på denne måde, er replikationsdefekt. Selv recPVs vist sig at have bedre oncotoxic aktiviteter med hensyn til forældrenes virus, hvorfra de er blevet genereret, deres produktion fortsat en stor udfordring og stærkt hæmmer brugen af disse stoffer i anti-cancer kliniske anvendelser.
Vi fandt, at introduktionen af en Ad-5 afledte vektor indeholdende E2a, E4 (ORF6) og VA RNA-gener (f.eks pXX6 plasmid) i HEK293T forbedret produktion af recPVs med mere end 10 gange i sammenligning med andre protokoller, der anvendes. Baseret på denne opdagelse har vi konstrueret en ny Ad-VP-hjælpercelle, der indeholder de genomiske adenovirale elementer nødvendige for at forbedre recPVs produktion samt parvoviros VP gen enhed 5. Anvendelsen af Ad-VP-helper tillader fremstilling af rec-PV'er anvendelse af en protokol, der udelukkende afhænger virusinfektion trin (i modsætning til plasmid transfektion), gør det muligt at anvende cellelinier, der er vanskelige at transficere (f.eks NB324K) ( figur 2). Vi præsenterer en fremgangsmåde, der forbedrer i høj grad mængden af rekombinant virus produceret, hvilket reducerer både produktionstid og omkostninger uden at påvirke kvaliteten af slutproduktet 5. Desuden er produktion i stor skala af recPV (i suspensionskulturer celler og bioreaktorer) nu tænkelige.
Protocol
Discussion
Vi har vist, at recPV produktion kan forøges ved tilstedeværelsen af adenoviralt, genomisk elementer. Vi har forøget recPV udbytter på mere end 10 fold (fra 0,3 til 5 TU / celle) ved at tilvejebringe adenovirus genome elementet via transfektion og med mere end 100 fold co-infektion af cellerne med Ad-VP-helper i kombination med recPV i Sammenlignet med konventionelle protokoller. Protokollen beskrevet her, kan optimeres yderligere ved at bestemme den mest hensigtsmæssige tidspunkt for levering af de adenovira…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker team af DKFZ virus produktion og udvikling enhed, især Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, og Mandy Roscher. Denne undersøgelse er blevet delvist støttet af tilskud fra Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF) og Helmholtz Association inden for rammerne af Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est-program i Applied Tumor virologi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
- Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
- Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
- El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
- Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
- He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
- Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).
