Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren
Summary
Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.
Abstract
Progranulin (PGRN), auch als granulin epithelin Vorstufe (GEP) bekannt, ist ein 593-Aminosäuren-autokrine Wachstumsfaktor. PGRN ist bekannt, dass eine kritische Rolle in einer Vielzahl von physiologischen und Krankheitsprozessen spielen, einschließlich der frühen Embryogenese, Wundheilung 1, Entzündung 2, 3, und Host-Sicherheitsebene 4. PGRN auch als neurotrophen Faktor 5, und Mutationen in der PGRN Gens zu einer teilweisen Verlust der PGRN Protein verursachen frontotemporale Demenz 6, 7. Unsere jüngsten Studien haben auf die Isolierung von PGRN als ein wichtiger Regulator des Knorpels Entwicklung und Abbau 8-11 geführt. Obwohl PGRN, entdeckte vor fast zwei Jahrzehnten, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, die Bemühungen um die Aktionen der PGRN nutzen und verstehen die beteiligten Mechanismen wurden erheblich durch unsere Unfähigkeit behindert, seine Bindung Rezeptor (en) zu identifizieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein modiFied Hefe-Zwei-Hybrid (MY2H) Ansatz, der auf die am häufigsten verwendeten GAL4 basierten 2-Hybrid-System. Gegenüber der konventionellen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen, MY2H verkürzt den Bildschirm und reduziert die Anzahl der falsch-positiven Klone. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig, und wir haben erfolgreich dieses System bei der Isolierung der Proteine aus verschiedenen Ködern, darunter Ionenkanal 12, extrazellulären Matrix Protein 10, 13, und Wachstumsfaktor 14 verwendet. In diesem Papier beschreiben wir diese MY2H experimentellen Verfahren im Detail mit PGRN als ein Beispiel, das zur Identifizierung von TNFR2 als der erste bekannte PGRN-assoziierten Rezeptors 14, 15 geführt.
Protocol
Discussion
Hefe-Zwei-Hybrid-Screening hat sich als wirksames Instrument bei der Identifizierung von Protein-Interaktion 16, 17 sein. Im Vergleich mit anderen Ansätzen zur Identifizierung von Protein-Bindungspartner, wie biochemische co-Reinigungs-und Protein-Chips, Hefe-Zwei-Hybrid-System ist ein sensibler genetischer Ansatz, der für das Screening sehr hohe Zahl von kodierenden Sequenzen in einer relativ einfachen Experiment verwendet werden können; in Zudem erkennt es die in vivo Interaktion und braucht keine kompli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH Forschungsstipendien K01AR053210, R01AR061484 und einen Zuschuss von der National Psoriasis Foundation finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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