Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina
Summary
Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.
Abstract
Progranulina (PGRN), también conocido como precursor granulina epithelin (GEP), es un factor de crecimiento autocrino 593-amino-ácido. PGRN se sabe que juega un papel crítico en una variedad de procesos fisiológicos y enfermedades, incluyendo principios de la embriogénesis, cicatrización de heridas 1, la inflamación 2, 3 y 4 de defensa del huésped. PGRN también funciona como un factor neurotrófico 5, y las mutaciones en el gen PGRN resultando en la pérdida parcial de la demencia frontotemporal causa PGRN proteínas 6, 7. Nuestros estudios recientes han conducido al aislamiento de PGRN como un importante regulador del desarrollo del cartílago y la degradación de 8-11. A pesar de PGRN, descubierto hace casi dos décadas, juega un papel crucial en varias condiciones fisiológicas y patológicas, los esfuerzos para aprovechar las acciones de PGRN y entender los mecanismos implicados han sido considerablemente obstaculizada por nuestra incapacidad para identificar su unión al receptor (s). Para solucionar este problema, hemos desarrollado una modiFIED dos híbridos de levadura (MY2H) enfoque basado en el más utilizado GAL4 basada en dos sistema híbrido. En comparación con la levadura convencional de dos híbridos de pantalla, MY2H reduce drásticamente el proceso de la pantalla y reduce el número de falsos positivos clones. Además, este método es reproducible y confiable, y hemos empleado con éxito este sistema en el aislamiento de las proteínas de unión de diversos cebos, incluidos los canales de iones 12, proteína de la matriz extracelular 10, 13, 14 y factor de crecimiento. En este trabajo se describe el procedimiento experimental MY2H en detalle utilizando PGRN como ejemplo, que condujo a la identificación de TNFR2 como el primero conocido PGRN asociada a los receptores 14, 15.
Protocol
Discussion
Levadura de dos híbridos de cribado ha demostrado ser una herramienta eficaz en la identificación de la interacción de proteínas 16, 17. En comparación con otros métodos para la identificación de la proteína de unión de la pareja, tales como la purificación bioquímica de proteínas y co-chips, dos híbridos de levadura es un enfoque sensible genética que puede ser utilizado para la detección de un número muy alto de las secuencias codificadoras de un experimento relativamente sencillo, en Ademá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones para la investigación K01AR053210, R01AR061484 y una beca de la Fundación Nacional de Psoriasis.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
| YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
| YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
| Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
| -Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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