Modifierad jäst-Two-Hybrid System för att identifiera proteiner Interagera med Growth Factor Progranulin

Summary

Vi har ändrat den konventionella jäst två-hybrid screening, ett effektivt genetiska verktyg för att identifiera protein interaktion. Denna ändring förkortar markant processen, minskar arbetsbördan, och viktigast, minskar antalet falska positiva. Dessutom är denna metod reproducerbar och tillförlitlig.

Abstract

Progranulin (PGRN), även känd som granulin epithelin föregångare (GEP), är ett 593 aminosyror autokrin tillväxtfaktor. PGRN är känd för att spela en avgörande roll i en mängd olika fysiologiska och sjukdom processer, inklusive tidig embryogenes, sårläkning ^1, inflammation ^{2, 3,} och värd försvar ^4. PGRN fungerar också som en Neurotrophic Factor ^5, och mutationer i PGRN genen resulterar i partiell förlust av PGRN proteinet orsakar frontotemporal demens ^{6, 7.} Våra senaste undersökningar har lett till isolering av PGRN som en viktig reglerare av brosk utveckling och nedbrytning ^8-11. Även PGRN upptäckte nästan två decennier sedan, spelar avgörande roller i flera fysiologiska och patologiska tillstånd, insatser för att utnyttja åtgärder PGRN och förstå om de berörda mekanismerna ha varit avsevärt försvårats av vår oförmåga att identifiera dess bindande receptor (er). För att lösa detta har vi utvecklat en modified jäst två-hybrid (MY2H) som bygger på de vanligaste GAL4 baserad 2-hybridsystem. Jämfört med konventionell jäst två-hybrid-skärm, förkortar MY2H dramatiskt skärmen processen och minskar antalet falska positiva kloner. Dessutom är denna metod reproducerbara och tillförlitliga, och vi har framgångsrikt används detta system i isolera proteiner av olika beten, bland jonkanal ^12, extracellulära matrix protein ^{10, 13} och tillväxtfaktor ^14. I denna skrift beskriver vi här MY2H experimentella förfarandet i detalj med hjälp av PGRN som ett exempel som ledde till identifiering av TNFR2 som den första kända PGRN-associerad receptor ^{14, 15.}

Protocol

1. Bakgrundsinformation Jästen två-hybrid systemet är en kraftfull genetisk teknik som används för att upptäcka protein-protein interaktioner 16, 17. Flera typer av 2-hybrid system, såsom lexa-baserade system, SOS-rekryteringssystem och bakterier eller däggdjursceller cellbaserade 2-hybrider, är kommersiellt tillgänglig, fokuserar denna uppsats specifikt om ändringar av de vanligaste GAL4 baserade jäst 2-hybridsystem. Korthet bygger metoden på egenskaperna hos jästen <…

Discussion

Jäst två-hybrid screening har visat sig vara ett effektivt verktyg för att identifiera proteininteraktioner ^{16, 17.} Jämfört med andra metoder för att identifiera protein-bindande partners, såsom biokemiska co-rening och proteinchip, jäst två-hybrid systemet är en känslig genetisk metod som kan användas för screening mycket stort antal av kodande sekvenser på ett relativt enkelt experiment, i Dessutom registrerar den att det in vivo interaktioner och behöver inte komplicerat protein rening. Natu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
ProQuest two-hybrid system	Invitrogen	10835
YPD Growth Medium	Clontech	630409
YPD Agar Medium	Clontech	630410
Minimal SD agar Base	Clontech	630412
-Leu DO Supplement	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO Supplement	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement	Clontech	630425
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonicated Salmon Sperm DNA	Stratagene	201190
Ampicillin	AMRESCO	0339
Kanamycin Sulfate	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells	Invitrogen	18265-017
Trizma® base	Sigma-Aldrich	T6066
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	162-0115
10-cm petri dish	ITI Scientific	CT-903
Incubator (30 °C)	ATR (Ecotron)