Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel
Summary
Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.
Abstract
Es gibt ein aktives Interesse an Peptiden, die leicht Zellmembranen ohne die Hilfe von Zellmembran-Rezeptoren 1. Viele von ihnen sind als Zell-penetrierende Peptide, die häufig auf ihr Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren 1-3 sind vermerkt bezeichnet. Darüber hinaus gibt es zunehmendes Interesse an antimikrobiellen Peptiden, die über nicht-Membran lytische Mechanismen 4,5, insbesondere jene, die bakteriellen Membranen voraussichtlich nicht durchdringt, ohne dass Zell-Lyse und töten Zellen durch Eingriffe in intrazellulären Prozessen 6,7 betreiben. In der Tat haben Autoren zunehmend die Beziehung zwischen zellpenetrierendes und antimikrobielle Peptide 1,8 hingewiesen. Ein tiefgehendes Verständnis des Prozesses der Membran-Translokation und die Beziehung zwischen Peptid-Struktur und seine Fähigkeit, translozieren erfordert eine effektive und reproduzierbare Tests für die Translokation. Mehrere Gruppen haben Methoden zur Translokation in großen unilamel vorgeschlagene Maßnahmelar Lipidvesikel (LUVs) 9-13. LUVs dienen als nützliche Modelle für bakterielle und eukaryontische Zellmembranen und sind häufig in der Peptid-Fluoreszenz-Studien 14,15 verwendet. Hier beschreiben wir unsere Anwendung der Methode zuerst von Matsuzaki und Mitarbeiter entwickelt, um antimikrobielle Peptide, wie Magainin und Buforin II 16,17 berücksichtigen. Neben der Bereitstellung von unserem Protokoll für diese Methode, stellen wir auch eine einfache Ansatz zur Datenanalyse, die Translokation Fähigkeit mit diesem Assay quantifiziert. Die Vorteile dieser Translokation Assay im Vergleich zu anderen sind, dass sie das Potenzial, um Informationen über die Rate der Membran Translokation bieten und erfordert nicht die Zugabe eines fluoreszierenden Markierung, die verändern Peptid Eigenschaften können 18, an Tryptophan-haltige Peptide hat. Kurz gesagt, ist die Translokation Fähigkeit in Lipidvesikel als Funktion der Foster Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einheimischen Tryptophan und d gemessenansyl Phosphatidylethanolamin, wenn die Proteine mit der externen assoziiert sind LUV-Membran (Abbildung 1). Cell-penetrierende Peptide gespalten werden, wie sie hemmungslos Trypsin mit dem LUVs gekapselt Begegnung führt zu Entfremdung von der LUV-Membran und einem Rückgang der FRET-Signals. Der Rückgang der FRET-Signals für eine Translokation Peptid beobachtet wird deutlich größer als die für das gleiche Peptid, wenn die LUVs sowohl Trypsin und Trypsin-Inhibitor, oder wenn ein Peptid, das nicht spontan funktioniert cross Lipidmembranen ist Trypsin-haltigen LUVs ausgesetzt enthalten beobachtet. Diese Änderung in der Fluoreszenz bietet eine direkte Quantifizierung der Peptid-Translokation über die Zeit.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten verwendet werden, um die relative Veränderung der Konzentration von Peptiden innerhalb und außerhalb von Lipidvesikeln beurteilen. Diese Änderungen werden Translokation Fähigkeit verbunden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zell-penetrierende Peptide mit Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren zu identifizieren. Da das Interesse in Zell-penetrierende Peptide wächst, wird es interessant sein zu sehen, wie Methoden, die direkt die Translokation entwickelt und in einer quantitati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Eleanor Fleming und Jessica Chen für hilfreiche Diskussionen danken. Die Finanzierung wurde von National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH-NIAID) Award R15AI079685 und ein Research Corporation Cottrell Hochschule Science Award zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Unterstützung der Studierenden wurde von der Howard Hughes Medical Institute und der Staley Fonds zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).
