13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.
Mikroben haben komplexe Stoffwechselwege, untersucht mit Hilfe der Biochemie und der funktionellen Genomik Methoden werden kann. Eine wichtige Technik, um Zelle zentralen Stoffwechsel untersuchen und entdecken neue Enzyme ist 13 C-assisted Stoffwechsel-Analyse 1. Diese Technik basiert auf Isotopenmarkierung, wobei Mikroben mit 13 C markierten Substraten zugeführt beruhen. Die Verfolgung der Atom Übergang Wege zwischen Metaboliten in die biochemische Netzwerk können wir bestimmen, funktionale Wege und entdecken neue Enzyme.
Als ergänzende Methode zur Transkriptom-und Proteomforschung, Ansätze für Isotopomer-gestützte Analyse von Stoffwechselwegen drei große Schritte 2 enthalten. Erstens, wir wachsen Zellen mit 13 C markierten Substraten. In diesem Schritt werden die Zusammensetzung des Mediums und die Auswahl der markierten Substraten zwei Schlüsselfaktoren. Um zu vermeiden, Mess-Geräusche aus nicht-markierten Kohlenstoffs in Nahrungsergänzungsmittel, Ist ein Minimal-Medium mit einer einzigen Kohlenstoffquelle erforderlich. Weiterhin ist die Wahl einer markierten Substrat, wie effektiv es wird der Weg zu analysierenden Aufklärung basiert. Da neuartige Enzyme beinhalten häufig unterschiedliche Reaktion Stereochemie oder Zwischenprodukte in der Regel einfach markierten Kohlenstoffsubstrate informativer für den Nachweis neuartiger Wege als einheitlich bezeichnet diejenigen für die Erkennung von neuen Bahnen 3, 4 sind. Zweitens analysieren wir Aminosäure Kennzeichnung Muster mit GC -MS. Aminosäuren sind reich an Protein und kann daher aus Biomasse Hydrolyse erhalten werden. Aminosäuren können durch N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatisiert vor GC-Trennung. TBDMS derivatisierten Aminosäuren kann durch MS und das Ergebnis in verschiedenen Arrays von Fragmenten fragmentiert. Bezogen auf die Masse zu Ladung (m / z)-Verhältnis von fragmentierten und unfragmentierte Aminosäuren, können wir ableiten, die möglichen beschriftet Muster der zentralen Metaboliten, dieVorläufer der Aminosäuren. Drittens verfolgen wir 13C Carbon-Übergänge in der vorgeschlagenen Wege und auf der Grundlage der Isotopomer Daten bestätigen, ob diese Wege Aktiv-2 sind. Messung von Aminosäuren bietet Isotopenmarkierung Informationen rund acht entscheidende Vorstufe Metaboliten in den zentralen Stoffwechsel. Diese metabolischen Schlüssel Knoten spiegeln die Funktionen der assoziierten mittel-Bahnen.
13 C-assisted Stoffwechsel-Analyse über proteinogenen Aminosäuren können sehr für die funktionelle Charakterisierung von schlecht charakterisiert mikrobiellen Stoffwechsel 1 verwendet werden. In diesem Protokoll werden wir Cyanothece 51142 als Modell Belastung verwenden, um die Verwendung markierter Kohlenstoff-Substraten für die Entdeckung neuer enzymatischer Funktionen zu demonstrieren.
Das Protokoll besteht aus Fütterung der Zelle mit einem markierten Substrat und Messung der daraus resultierenden Isotopenmarkierung Muster in den Aminosäuren via GC-MS. Da MS-Daten (m / z-Verhältnisse) nur der Gesamtbetrag der Kennzeichnung von MS-Ionen geben, haben wir auf die Isotopomer Ausschüttungen von Aminosäuren durch die Untersuchung der m / z-Verhältnisse der beiden unfragmentierte (M-57) + und fragmentiert Aminosäuren zu bewerten (dh, (M-159) + und (F302) +). Darüber h…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von einem NSF Career Grant (MCB0954016) und DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |