Metabolismväg Bekräftelse och upptäckt genom 13 C-märkning av proteinogena aminosyror
Summary
13 C-isotopen märkning är en användbar teknik för att bestämma cellens centrala metabolism för olika typer av mikroorganismer. Efter celler har odlats med en märkt visst substrat, kan GC-MS mätning avslöjar funktionella metabola vägar bygger på en unik märkning mönster i proteinogena aminosyror.
Abstract
Mikroberna har komplexa metaboliska vägar som kan undersökas med hjälp av biokemi och funktionell genomik metoder. En viktig teknik för att undersöka cellens centrala metabolism och upptäck nya enzymer är 13 C-assisterad metabolism analys 1. Denna teknik bygger på isotop märkning, där mikrober matas med en 13 märkta C substrat. Genom att spåra stigar atomen övergången mellan metaboliter i biokemiska nätverk kan vi bestämma funktionella vägar och upptäcka nya enzymer.
Som en kompletterande metod för att transcriptomics och proteomik, tillvägagångssätt för isotopomer-assisterad analys av metaboliska vägar innehåller tre stora steg 2. För det första växer vi celler med 13 märkta C substrat. I det här steget, sammansättningen av mediet och valet av märkta substrat är två viktiga faktorer. För att undvika mätning ljud från omärkta kol i näringsämne kosttillskottÄr en minimal medium med ett enda kolkälla krävs. Vidare är valet av en märkt substrat baserat på hur effektivt det kommer att belysa vägen som analyseras. Eftersom nya enzymer ofta medför olika reaktioner stereokemi eller mellanprodukter i allmänhet, var för sig märkt kol substrat är mer informativa för att upptäcka nya vägar än enhetligt märkt dem för att upptäcka nya vägar 3, 4. För det andra analyserar vi aminosyran mönster syra märkning med GC -MS. Aminosyror är rik på protein och därmed kan erhållas från biomassa hydrolys. Aminosyror kan derivatiserade av N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) innan GC separation. TBDMS derivatiserade aminosyror kan vara splittrat av MS och resulterar i olika kedjor av fragment. Baserat på massa för att laddning (m / z) ratio på fragmenterade och unfragmented aminosyror, kan vi härleda möjliga märkt mönster av de centrala metaboliter somprekursorer av aminosyror. tredje spår vi 13C kol övergångar i den föreslagna vägar och, baserat på isotopomer data, bekräfta om dessa vägar är aktiva 2. Mätning av aminosyror ger isotop märkning information om åtta viktiga föregångare metaboliter i de centrala ämnesomsättningen. Dessa metabola viktiga noder kan spegla funktioner associerade central-vägar.
13 C-assisterad metabolism analys via proteinogena aminosyror kan ofta används för funktionell karakterisering av dåligt kännetecknas mikrobiell metabolism 1. I detta protokoll kommer vi att använda Cyanothece 51.142 som modell stam att demonstrera användningen av märkt kol substrat för att upptäcka nya enzymatiska funktioner.
Protocol
Discussion
Detta protokoll består av utfodring cellen med en märkt substrat och mäta den resulterande isotopisk märkning mönster i de aminosyror via GC-MS. Eftersom MS-data (m / z-förhållanden) ge bara det totala beloppet för märkning av MS-joner, måste vi bedöma isotopomer distributioner av aminosyror genom att undersöka m / z förhållande både unfragmented (M-57) + och fragmenterad aminosyror (dvs (M-159) + och (F302) +). Dessutom kan vi utföra flera cellodlingar med ett kemiskt id…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av en NSF Career Grant (MCB0954016) och en DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
| GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |
References
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -. H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , (2011).
- Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).
