Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie
Summary
Deze methode maakt het mogelijk controle van de cellen in real time en kwantitatieve metingen van verschillende celmigratie parameters, zoals snelheid, verplaatsing, en snelheid. In tegenstelling tot de traditionele methoden, is deze real-time benadering niet gebaseerd op eindpunt kwantitatieve migratie metingen, in plaats daarvan het laat de controle en het berekenen van verschillende parameters continu.
Abstract
Cel migratie is een dynamisch proces, wat belangrijk is voor de embryonale ontwikkeling, weefselherstel, werking van het immuunsysteem, en tumor invasie 1, 2. Tijdens directionele migratie cellen snel bewegen in reactie op een extracellulair chemotactische signaal, of als reactie op signalen intrinsieke 3 door de basis motiliteit machines. Willekeurige migratie doet zich voor wanneer een cel bezit lage intrinsieke gerichtheid, waardoor de cellen aan hun lokale omgeving te verkennen.
Cel migratie is een complex proces, bij de eerste respons cel ondergaat polarisatie en strekt zich uitsteeksels in de richting van de migratie 2. Traditionele methoden om migratie, zoals de Boyden kamer migratie test te meten is een eenvoudige methode om te meten chemotaxis in vitro, die het mogelijk maakt het meten van migratie als een eindpunt resultaat. Echter, deze benadering laat geen meting van de individuele migratie parameters, noch is het in staat te stellen Visualization van de morfologische veranderingen die cel ondergaat tijdens de migratie.
Hier presenteren we een methode die ons in staat stelt om migrerende cellen in real time met behulp van video – time lapse microscopie. Sinds celmigratie en invasie zijn kenmerken van kanker, zal deze methode van toepassing zijn in het bestuderen van kankercel migratie en invasie in vitro. Willekeurige migratie van bloedplaatjes wordt beschouwd als een van de parameters van de functie van de bloedplaatjes 4, vandaar deze methode kan ook nuttig zijn in het bestuderen van bloedplaatjes functies. Deze test heeft het voordeel dat snel en betrouwbaar en reproduceerbaar, en vereist geen optimalisatie van celaantallen. Om fysiologisch geschikte omstandigheden voor cellen te handhaven wordt de microscoop voorzien CO 2 toevoer en thermostaat. Cell beweging gevolgd door's in een camera aangebracht op de microscoop bij regelmatige intervallen. Celmigratie kan worden berekend door de gemiddelde snelheid enverage verplaatsing berekend door Slidebook software.
Protocol
Discussion
De real-time willekeurige migratie-test maakt een nauwkeurige, gevoelige, analyse van celmigratie parameters, zoals snelheid en verplaatsing. Deze methode is niet beperkt tot punt meetwaarde beëindigen vandaar is kwantitatief. Aangezien worden cellen gecontroleerd normale DMEM medium met serum, vermindert de nadelige gevolgen van meer incubatie in serumvrij medium. Gebleken is dat de verplaatsing van cellen is afhankelijk van de opmaak en breken cel contact met het substraat 8, zodat deze methode kan worden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Amanda Struckhoff bedanken voor de eerste hulp met het experiment. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
