Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Summary

Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.

Abstract

A migração celular é um processo dinâmico, que é importante para o desenvolvimento embrionário, a reparação de tecidos, a função do sistema imunitário, e invasão tumoral ^{1, 2.} Durante a migração direccional, as células movem-se rapidamente em resposta a um sinal de quimiotáctico extracelular, ou em resposta a estímulos intrínsecas ³ fornecidos pela máquina motilidade de base. A migração aleatória ocorre quando uma célula possui direccionalidade intrínseca baixa, permitindo que as células para explorar seu ambiente local.

A migração celular é um processo complexo, na célula resposta inicial sofre polarização e estende-se saliências na direcção da migração ^2. Os métodos tradicionais para medir a migração, tais como o ensaio de migração Boyden câmara é um método fácil de medir a quimiotaxia in vitro, o que permite medir a migração como um resultado de ponto final. No entanto, esta abordagem não permite a medição de parâmetros de migração individuais, nem permite a visualização de alterações morfológicas que celular durante a migração.

Aqui, apresentamos um método que nos permite monitorar as células migram em tempo real usando o vídeo – microscopia de lapso de tempo. Desde a migração celular ea invasão são marcas registradas de câncer, este método será aplicado no estudo da migração de células cancerosas e invasão in vitro. A migração aleatória de plaquetas tem sido considerada como um dos parâmetros de ⁴ a função das plaquetas, por conseguinte, este método pode também ser útil no estudo da função plaquetária. Este ensaio tem a vantagem de ser rápida, fiável e reprodutível, e não necessita de optimização de números de células. A fim de manter as condições fisiologicamente adequados para as células, o microscópio é equipado com CO fornecimento ₂ e termostato temperatura. O movimento celular é monitorizada por tirar fotografias com uma câmara montada no microscópio em intervalos regulares. A migração celular pode ser calculado medindo a velocidade média e umdeslocamento MÉDIO, que é calculado pelo software Slidebook.

Protocol

1. Preparação da placa revestida com colágeno Diluir colagénio para uma concentração final de 10 ug / ml em OPTI-MEM meios de comunicação. Casaco 6 placas de poços com colagénio, pela adição de 1,5 ml a partir do passo 1 a cada poço. Incubar durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lavar a placa 2 vezes com fosfato 1x salino tamponado (PBS) e armazená-los em PBS. 2. Preparação de células e Sementeira em uma placa de 6 poços <p class=…

Discussion

O tempo real ensaio de migração aleatória permite precisas, a análise, sensível dos parâmetros celulares tais como a velocidade de migração e deslocamento. Este método não é restrita ao fim valor da medição do ponto, por isso é mais quantitativa. Uma vez que, as células são monitorizados em meio DMEM com soro normal de, que reduz o efeito deletério de incubação mais longo em soro meios livres. Tem sido demonstrado que a migração de células depende da formatação e quebrando contactos celulares com…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gemini Bio- Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagen	BD	354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller	Olympus	Olympus 1X81
Environmental control chamber	Neue	Neue Live Cell Chamber	Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage	Prior	Prior Proscan	This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera		Hamamatsu EM camera C9100
Software	Typically purchased through microscope vendor such as Olympus	Slide Book 5